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Analisi statistica di accumulo lipidico in epatociti determinato mediante imaging vibrazionale
FACOLTÀ DI SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
CORSO DI LAUREA IN FISICA
Anno Accademico 2013/14
Relatore: Prof. Tullio ScopignoCorrelatore: Dott.ssa Abigail Nunn
Candidato: Saltarelli Francesco
Roma, 26 Settembre 2014
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Analisi statistica di accumulo lipidico in epatociti determinato mediante imaging vibrazionale
Introduzione
Attraverso degli script in ambiente Matlab andremo ad analizzare la disposizione di tali goccioline seguendo le fasi indicate:
1. Acquisizione
2. Processing
• Threshold e Watershed
• Identificazione delle gocce in 3D
3. Calcolo funzione di distribuzione radiale
• Problema PBC
• Test su simulazione LJ
• Correzione /
4. Applicazione a immagini acquisite
Negli epatociti vi può essere un accumulo anomalo di lipidi sotto forma di goccioline:• dovuto a patologie (steatosi
epatica, cancro)• indotto esternamente (acido oleico,
entinostat)
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Healthy liver Fatty liver
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Diffusione a singolo fotone da parte di una molecola:• Elastica → Rayleigh• Anelastica → Raman
Diffusione a più fotoni:• CARS (Coherent Anti-Stokes Raman Scattering):
Nei lipidi si sfrutta la riga vibrazionale di stretching del legame a:
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FASI DELL’ANALISI:
1. Acquisizione
2. Processing• Threshold e Watershed• Identificazione delle
gocce in 3D
3. Calcolo funzione di distribuzione radiale
• Problema PBC• Test su simulazione LJ• Correzione /
4. Applicazione a immagini acquisite
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Schema microscopio invertito CARSFASI DELL’ANALISI:
1. Acquisizione
2. Processing• Threshold e Watershed• Identificazione delle
gocce in 3D
3. Calcolo funzione di distribuzione radiale
• Problema PBC• Test su simulazione LJ• Correzione /
4. Applicazione a immagini acquisite
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Stack di immagini associato ad una cellula(trattamento: acido oleico + entinostat)
FASI DELL’ANALISI:
1. Acquisizione
2. Processing• Threshold e Watershed• Identificazione delle
gocce in 3D
3. Calcolo funzione di distribuzione radiale
• Problema PBC• Test su simulazione LJ• Correzione /
4. Applicazione a immagini acquisite
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Nella fase di processing otteniamo dallo stack di immagini acquisite al microscopio posizione e area di ogni goccia per ogni layer
Threshold: si fissano due soglie, i pixel con un'intensità al loro interno rappresentano il segnale, gli altri lo sfondo nero
Watershed: divide le gocce rimaste unite cercando il loro centro e dilatandolo finche’ incontra un’altra goccia o raggiunge il limite della goccia stessa a cui il centro appartiene
FASI DELL’ANALISI:
1. Acquisizione
2. Processing• Threshold e Watershed• Identificazione delle
gocce in 3D
3. Calcolo funzione di distribuzione radiale
• Problema PBC• Test su simulazione LJ• Correzione /
4. Applicazione a immagini acquisite
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Algoritmo interno Fiji: si fissa una soglia di threshold uguale per l’intero stack e poi si esegue il watershed
3D Iterative Thresholding plugin: sceglie una soglia di threshold diversa per ogni goccia seguendola sull’intero stack di immagini e tiene quella che massimizza il volume
FASI DELL’ANALISI:
1. Acquisizione
2. Processing• Threshold e Watershed• Identificazione delle
gocce in 3D
3. Calcolo funzione di distribuzione radiale
• Problema PBC• Test su simulazione LJ• Correzione /
4. Applicazione a immagini acquisite
Il plugin esterno ha prestazioni migliori in termini di capacità di distinguere le gocce e stimarne le dimensioni
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Inseguimento di una goccia:Dato un certo layer e su di esso una goccia si va a calcolare per ogni goccia sul layer seguente più interno la quantità:
Le gocce e sono identificate come la stessa su layer diversi se:
FASI DELL’ANALISI:
1. Acquisizione
2. Processing• Threshold e Watershed• Identificazione delle
gocce in 3D
3. Calcolo funzione di distribuzione radiale
• Problema PBC• Test su simulazione LJ• Correzione /
4. Applicazione a immagini acquisite
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Mappa delle gocce di lipidi in una cellulaFASI DELL’ANALISI:
1. Acquisizione
2. Processing• Threshold e Watershed• Identificazione delle
gocce in 3D
3. Calcolo funzione di distribuzione radiale
• Problema PBC• Test su simulazione LJ• Correzione /
4. Applicazione a immagini acquisite
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La funzione di distribuzione radiale in un sistema di particelle, descrive come varia la densità in funzione della distanza da una particella presa come riferimento
FASI DELL’ANALISI:
1. Acquisizione
2. Processing• Threshold e Watershed• Identificazione delle
gocce in 3D
3. Calcolo funzione di distribuzione radiale
• Problema PBC• Test su simulazione LJ• Correzione /
4. Applicazione a immagini acquisite
→ con distanza fra i centri delle particelle
→ con distanza fra i bordi delle particelle
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Nel caso di volume finito possiamo:
• tenere conto del volume effettivo in cui cerchiamo vicini per le particelle al bordo;
• introdurre PBC (minimum image convention)
Ciò non è applicabile al caso delle cellule dove il bordo non è ben definito
FASI DELL’ANALISI:
1. Acquisizione
2. Processing• Threshold e Watershed• Identificazione delle
gocce in 3D
3. Calcolo funzione di distribuzione radiale
• Problema PBC• Test su simulazione LJ• Correzione /
4. Applicazione a immagini acquisite
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per particelle puntiformi uniformemente distribuite:• con PBC → costante al valore 1• senza PBC → decadimento anomalo, previsto
analiticamente tenendo presente l’area effettiva dove vengono cercati vicini per le particelle al bordo
FASI DELL’ANALISI:
1. Acquisizione
2. Processing• Threshold e Watershed• Identificazione delle
gocce in 3D
3. Calcolo funzione di distribuzione radiale
• Problema PBC• Test su simulazione LJ• Correzione /
4. Applicazione a immagini acquisite
𝑔𝑢𝑛𝑖𝑓2𝐷 (𝑟 )= 1
𝑙𝑥⋅𝑙 𝑦⋅¿
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Per particelle che evolvono in un certo volume potremo correggere la ottenuta senza PBC detta , calcolando la ossia la per particelle puntiformi disposte uniformemente nello stesso volume:
FASI DELL’ANALISI:
1. Acquisizione
2. Processing• Threshold e Watershed• Identificazione delle
gocce in 3D
3. Calcolo funzione di distribuzione radiale
• Problema PBC• Test su simulazione LJ• Correzione /
4. Applicazione a immagini acquisite
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Nel caso delle cellule resta il problema di definire un’area effettiva, ossia una zona dove la distanza fra le gocce è paragonabile alle dimensioni stesse di queste ultime; lo facciamo dividendo l’immagine in rettangolini e stabilendo una densità di soglia
FASI DELL’ANALISI:
1. Acquisizione
2. Processing• Threshold e Watershed• Identificazione delle
gocce in 3D
3. Calcolo funzione di distribuzione radiale
• Problema PBC• Test su simulazione LJ• Correzione /
4. Applicazione a immagini acquisite
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calcolata in 2DFASI DELL’ANALISI:
1. Acquisizione
2. Processing• Threshold e Watershed• Identificazione delle
gocce in 3D
3. Calcolo funzione di distribuzione radiale
• Problema PBC• Test su simulazione LJ• Correzione /
4. Applicazione a immagini acquisite
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calcolata in 2DFASI DELL’ANALISI:
1. Acquisizione
2. Processing• Threshold e Watershed• Identificazione delle
gocce in 3D
3. Calcolo funzione di distribuzione radiale
• Problema PBC• Test su simulazione LJ• Correzione /
4. Applicazione a immagini acquisite
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calcolata in 3DFASI DELL’ANALISI:
1. Acquisizione
2. Processing• Threshold e Watershed• Identificazione delle
gocce in 3D
3. Calcolo funzione di distribuzione radiale
• Problema PBC• Test su simulazione LJ• Correzione /
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calcolata in 3DFASI DELL’ANALISI:
1. Acquisizione
2. Processing• Threshold e Watershed• Identificazione delle
gocce in 3D
3. Calcolo funzione di distribuzione radiale
• Problema PBC• Test su simulazione LJ• Correzione /
4. Applicazione a immagini acquisite
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FASI DELL’ANALISI:
1. Acquisizione
2. Processing• Threshold e Watershed• Identificazione delle
gocce in 3D
3. Calcolo funzione di distribuzione radiale
• Problema PBC• Test su simulazione LJ• Correzione /
4. Applicazione a immagini acquisite
Cellula trattata con acido oleico e entinostat
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FASI DELL’ANALISI:
1. Acquisizione
2. Processing• Threshold e Watershed• Identificazione delle
gocce in 3D
3. Calcolo funzione di distribuzione radiale
• Problema PBC• Test su simulazione LJ• Correzione /
4. Applicazione a immagini acquisite
Cellula trattata con acido oleico
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Prospettive future
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La funzione di distribuzione radiale ha delle caratteristiche peculiari che rispecchiano aspetti osservabili qualitativamente nelle immagini come:• presenza di picchi → ordine nella disposizione delle gocce• posizione dei picchi → disposizione più o meno compatta delle gocce• larghezza dei picchi → diversità nelle dimensioni delle gocce
L’idea, a lungo termine, è quella di costruire una banca dati con tali informazioni e confrontare la risposta delle cellule a diversi trattamenti, al fine di avere più chiaro il loro effetto