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RICERCA DEI MICOBATTERI NEL SANGUE
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L’infezione tubercolare
• I micobatteri vengono liberati nell’aria, all’interno di goccioline di saliva (droplet nuclei), dai soggetti affetti da tubercolosi polmonare
• I droplet <5μm rimangono a lungo in sospensione nell’aria e, se inalati, possono raggiungere gli alveoli polmonari
• Negli alveoli i micobatteri vengono fagocitati dai macrofagi non attivati ma riescono a moltiplicarsi al loro interno uccidendoli
• Il processo flogistico e l’attivazione dei macrofagi riescono, nella grande maggioranza dei casi, ad arginare l’infezione con formazione del processo primario
• Nel 5% dei casi si instaura la malattia tubercolare (primaria)• La tubercolosi (post-primaria) può manifestarsi, nel 5% degli infetti,
per riattivazione del processo primario in seguito all’abbassamento delle difese immunitarie
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Il Mycobacterium tuberculosis nel sangue
• Una breve fase batteriemica può aversi durante l’infezione primaria allorché alcuni micobatteri possono passare nel torrente circolatorio, per via linfatica, e raggiungere i distretti più disparati
• Una fase batteriemica prolungata si ha nelle forme disseminate (tubercolosi miliare)
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Le micobatteriosi
• Le infezioni da micobatteri non tubercolari si acquisiscono dall’ambiente
• La via di ingresso può essere respiratoria o alimentare• La malattia si instaura soltanto in presenza di fattori
predisponenti fra le quali il principale è l’abbassamento delle difese immunitarie
• Forme più comuni:– respiratoria (terza età)– linfoghiandolare (infanzia)– intestinale (AIDS)– disseminata (AIDS)
• Nella forma disseminata si ha micobatteriemia prolungata
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Breve storia dell’emocoltura per micobatteri
• 1917 M. C. Clough. The cultivation of tubercle bacilli from circulating blood in miliary tuberculosis. Am.Rev.Tuberc.
• 1932 L. Shapiro. The frequency of bacillemia in tuberculosis. Am.Rev.Tuberc. • 1935 K. A. Jensen. Report on investigations regarding the Loewenstein
technique of culturing tubercle bacilli from blood. Acta Tuberc.Scand. • 1980 W. Landau, J. Feczko, and R. L. Kaplan. Radiometric detection of
mycobacteria in routine blood cultures. J.Clin.Microbiol. • 1983 J. L. Elliott, W. L. Hoppes, M. S. Platt, J. G. Thomas, I. P. Patel, and A.
Gansar. The acquired immunodeficiency syndrome and Mycobacterium avium-intracellulare bacteriemia in a patient with hemophilia. Ann.Intern.Med.
• 1984 L. Srtockman, G. D. Roberts, and D. M. Ilstrup. Effect of storage of the Du Pont lysis-centrifugation system on recovery of bacteria and fungi in a prospective clinical trial. J.Clin.Microbiol.
• 1988 M. B. Agy, C. K. Wallis, J. J. Plorde, L. C. Carlson, and M. B. Coyle. Evaluation of four mycobacterial blood culture media: BACTEC 13A, Isolator/BACTEC 12B, Isolator/Middlebrook agar, and a biphasic medium. Diagn.Microbiol.Infect.Dis.
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Il prelievo
• Campione di sangue– direttamente nel flacone solo con i flaconi dedicati ai
micobatteri• problema dei flaconi radioattivi
– in assenza di flaconi dedicati• in provetta (almeno 5 ml) con eparina• in provetta con SPS
• Numero di prelievi– tre, preferibilmente in giorni diversi e prima dell’inizio
della terapia; ininfluente il momento del prelievo
• Conservazione del prelievo– a temperatura ambiente, anche per alcuni giorni
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Diagnostica delle micobatteriemie
• Esame microscopico (inutile)• Esame colturale
– primi approcci rudimentali – semina dopo lisi-centrifugazione– semina diretta in terreno liquido
dedicato
• Amplificazione genica (problematica)
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La lisi-centrifugazione
• Anticoagulante SPS, saponina• Centrifugazione per 30 min• Aspirazione e scarto del
supernatante• Semina del sedimento su:
– terreno solido (possibilità di conta)– terreno liquido o bifasico
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I terreni liquidi per emocoltura
• Semina diretta– BACTEC 13A– BacT ALERT MB Blood– BACTEC MYCO/F Lytic
• permette anche l’isolamento dei miceti
• Semina previa lisi-centrifugazione– Middlebrook 7H9– BACTEC 12B– BacT ALERT MP Process– ESP Myco
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I sistemi automatici
• BACTEC 460TB– radiometria: liberazione di CO2 radiomarcata
• MB/BacT Alert 3D – refrattometria: variazione dell’intensità luminosa di
un raggio in seguito alla riflessione su un sensore di CO2
• BACTEC, serie 9000/F– fluorimetria: emissione di fluorescenza da parte di un
sensore di O2
• ESP II– pressometria: rilevamento della diminuzione di
pressione conseguente al consumo di O2
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Sintesi delle procedure di laboratorio 1
• Eventuale trasferimento nel flacone da emocoltura
• Incubazione per 60 gg. o fino al momento della positivizzazione
• In caso di positività strumentale– preparato microscopico, per mettere in evidenza
microorganismi alcol-acido resistenti• in caso di positività del vetrino, semina su terreno specifico
per micobatteri
– semina su terreno non specifico per micobatteri e non selettivo, per evidenziare eventuali contaminazioni
– ripresa dell’incubazione in caso di negatività del preparato e della coltura
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• Test di ibridizzazione mediante DNA-probe sulle colonie micobatteriche cresciute nella subcoltura– M. tuberculosis complex
• identificazione biochimica a livello di specie• antibiogramma
– identificazione come micobatterio non tubercolare appartenente ad una delle 15 specie di più frequente isolamento
– identificazione come micobatterio non tubercolare non appartenente a nessuna delle 15 specie di più frequente isolamento
• identificazione a livello di specie mediante HPLC o test biochimico-colturali
Sintesi delle procedure di laboratorio 2
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Emocolture “non negative”
• Fra campioni segnalati come positivi dall’apparecchio automatico sono incluse– le vere positività– le “contaminazioni”– le false positività transitorie
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Interpretazione dei risultati
• Non essendo i micobatteri presenti sulla cute, in caso di positività dell’emocoltura per micobatteri, la contaminazione del campione non è ipotizzabile ed anche un solo isolamento è da ritenersi significativo
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Emocolture per micobatteri eseguite negli ultimi 12 anni
0 200 400 600 800 1000 1200
1991
1992
1993
1994
1995
1996
1997
1998
2000
2001
2002
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Percentuali di positività
1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002
0
2
4
6
8
10
12
percentuale di positività test eseguiti (centinaia)
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Mycobacterium avium complex
0
10
20
30
40
50
1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 2000 2002
MAC-X M. intrecellulare M. avium
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Mycobacterium tuberculosis
0
1
2
3
4
5
6
7
8
1992 1993 1995 1996 1997 1998 1999 2001 2002
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Altri micobatteri
0
2
4
6
8
1992 1993 1994 1995 1996 1997 2001 2002
M. kansasii
M. celatum
M. xenopi
M. genavense
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Tempi di positivizzazione, in settimane
I1%
II34%
III26%
IV6%
VI6%
VII5% VIII
6% >VIII4%
V12%
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Cinetica di crescita di alcune specie micobatteriche
1020
3040
5060
0
200
400
600
800
1000
GI
giorni
M. genavense M. tuberculosis M. avium
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Infezioni micobatteriche e livello dei linfociti CD4+
0100200300
400500
CD4/ml
tempo
M. tuberculosis
MAC
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Considerazioni sulla nostra casistica
• Le prime micobatteriemie sono comparse con qualche anno di ritardo rispetto agli USA
• Nei primi anni si isolava quasi esclusivamente il M. tuberculosis
• Repentina impennata dei MAC negli anni centrali dell’ultimo decennio del secolo scorso
• Nessun ritardo, per l’isolamento di altre specie micobatteriche, rispetto ad altri paesi
• Con l’introduzione degli inibitori delle proteasi, gli isolamenti di MAC, peraltro già in flessione, sono quasi scomparsi
• Ancora tutta da valutare l’inattesa impennata di isolamenti dell’ultimo anno
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Coltura del sangue mestruale
• Sistema di elezione per la diagnosi di annessiti tubercolari
• Raccolta sterile problematica• Alte percentuali di
contaminazioni
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Conclusioni• Dopo gli incrementi vertiginosi degli anni ’90 la richiesta
sembrava essersi stabilizzata; nell’ultimo hanno ha presentato però un brusco incremento
• La percentuale di positivizzazione oscilla attorno al 1% • Probabilmente c’è spazio per una riduzione delle richieste, ma
l’utilità dell’emocoltura per micobatteri non è in discussione • Gli isolamenti di M. avium sono stati drasticamente
ridimensionati dai progressi nella terapia anti-retrovirale• Gli isolamenti di M. tuberculosis sono rimasti pressoché invariati• Gli isolamenti di altre specie sono diventati eccezionali• Non è possibile prescindere dall’impiego di terreni liquidi • La consuetudine di eseguire il test su tre campioni non sembra
giustificata• L’ incubazione dovrebbe essere prolungata fino ad otto
settimane