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Qualità del frutto: strategie molecolariper il monitoraggio dei geni coinvolti
Gaetano Perrotta
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• Forma• Pigmentazione• Consistenza• Sapore/Aroma• Elementi nutrizionali
Durante la maturazione:
• Modificazione dell’ultrastruttura della parete cellulare• Conversione dell’amido in zuccheri• Aumenta la suscettibilità a patogeni• Biosintesi e accumulo di pigmenti• Aumentano i livelli dei composti volatili
Principali Caratteristiche del Frutto
Elevata variabilità
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• Mappa Genetica• Clonaggio Posizionale
Gene tagging• transposoni• T-DNA
Caratterizzazione Molecolare
Genomica/bioinformatica• Sequenziamento• Analisi di Espressione
Interazioni proteina-proteina• Sistema del doppioibrido
Manipolare l’assetto genetico per ilmigloramento delle specie coltivate
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L’ espressione dell’informazione genetica raccolta nellemolecole di DNA, avviene in due stadi:
–(i) trascrizione, durante la quale il DNA è trascritto inmRNA
–(ii) traduzione, durante la quale l’ mRNA è tradotto perprodurre la proteina associata
DNA mRNA protein
Dogma Centrale
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Materiale Vegetale
+USB35
Queen
Tratti evidenziati
Produzione incrementata
Gusto eccellente
Frutto rosso, brillante eluminoso
Periodo di conservazionepiù lungo
Resistente agli stress
X
MISS MAYA
ONDA
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Caratteri quali-quantitativi
Genotipo Consistenza del frutto (g)*SSC**TA***Produttività****Queen 571 7.3 9.9 910Miss 334 6.1 8.1 696USB35 434 7.8 12.5 530Maya 345 6.6 10.6 826Onda 340 6.1 7.9 615
*: test penetrometrico (diametro 6mm)**: contenuto solidi solubili (°Brix)***: acidità titolabile (meq (100 g-1))****: produttività totale (g/pianta)
Fonte: Monografia di cultivar di fragola – Faedi et al. (2003)
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• I DNA chip o microarrays sono costituiti da centinaia (omigliaia) di microgocce di DNA depositati su un supportogeneralmente costituito da un vetrino da microscopio (ognispot rappresenta un gene). La miniaturizzazione che nederiva, consente di fare analisi su scala genomica o sub-genomica.
• Il DNA immobilizzato sul vetrino puo’ essere utilizzato inreazioni di ibridazione o in altre reazioni enzimatiche.
• I DNA microarrays sono si solito utilizzati per ilmonitoraggio dell’attività trascrizionale su scala genomicao sub-genomica.
DNA Chip
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Microarray di Fragaria
3 x 1870 =5610 spots
Spot triplicati
10Geni controllo
49Geni candidati
1811ESTsselezionate
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cDNA Microarrays
AAAAAAAAAAA
mRNA
Fluorescent probe
Hybridize
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAA
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Comparative Profiling Analisi dei dati
Emissione
Laser 1 Laser 2
Scanning
Schema sperimentale
Miss /USB35/Maya/Onda (Test)
Queen(controllo)
Estrazione RNA totale
Sintesi cDNAfluorescente
Ibridazione
Cy5 Cy3
Test/Controllo > 2Test/Controllo = 1Test/Controllo < 0.5
Immagine rossa
Immagine verde+
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Espressione differenziale dei geni Miss,USB35,Maya e Onda vs. Queen
-2.00
-1.00
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
SAAT CC
RsnR
NA exp4
UKN3
UKN4
1-am
inocic
loprop
ano Cel1
UKN5
UKN6 Ap
xbH
LHtub
ulina
EST0
0001
F1 A
TPase UK
N1UK
N2 Hsp2
ethyle
ne dio
xygen
ase
peptid
ilprolil
isom
erasi aux
-rcas
einaCA
D Hsp
Geni
Log
2 Ra
tio
Miss vs QueenUSB35 vs QueenMaya vs QueenOnda vs Queen
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I geni CCR e CAD sono rispettivamente sovra- e sottoespressi nei frutti molli
CCR
Flavonoids Lignin
p-Coumaroyl-CoA
Stilbenes
Aldehydes Monolignolalcohols
CADCinnamyl alcoholdeidrogenasi
Cinnamoyl-CoAreduttasi
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Il gene Alcohol AcylTransferase (AAT) èsottoespresso nella cv
Queen
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Profiling del frutto in maturazione in pomodoro
• Frutto immaturo / Foglia• Frutto Breaker / Foglia• Frutto rosso / Foglia
Microarray con 12.000geni di pomodoro
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regolazione
fotosintesi
ripening
parete cellulare
proteine DNA/RNA
difesa
funzione sconosciuta
stress
metabolismo primario
Profiling Trascrizionaledi Pomodoro in Maturazione
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Considerazioni conclusive
Questi risultati dimostrano che il profilingtrascrizionale in cultivar dalle caratteristichedifferenti permette di identificare geni ofamiglie geniche potenzialmente coinvoltinell’espressione di caratteri qualitativi delfrutto.
L’efficacia di questo approccio èproporzionale alla rappresentatività delmicroarray.
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Genomica
Bioinformatica
Trascrittomica
Proteomica
Identificazione deifattori genetici
coinvoltinell’espressione dicaratteri qualitativi
Metabolomica
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• F. Carbone - Tesista • L. Caracciolo - Tesista• F. Giorno - Contrattista• F. Mourgues - Borsista• C. Rosati - Ricercatore
• G. Giuliano• W. Faedi I.S.F. Forlì
Partecipanti: Collaborazioni:
CasacciaTrisaiaTrisaiaTrisaiaTrisaiaTrisaia