ogm : organismi geneticamente modificati · ogm : organismi geneticamente modificati organismi...
TRANSCRIPT
OGM : organismi geneticamente modificati
Organismi ottenuti tramite manipolazione genica. Caratterizzati dalla presenza di modifiche nel genoma introdotte in maniera artificiale. Le tecniche di manipolazione genica consentono di trasformare singole cellule. Per ottenere organismi geneticamente modificati è necessario ricorrere a tecniche che consentono la riproduzione di un intero organismo a partire da una singola cellula. Tecniche diverse per ottenere OGM animali e vegetali
Diversi sistemi di espressione
Batteri Lievito Baculovirus Cellule di mammifero Piante Animali transeginici
Caracteristica E. coli Lievito Cell. Insetto Cell. Mammifero
Crescita 30 min 90 min 18-24 h 24 h
Terreno Semplice Semplice Complesso Complesso
Costo coltura Basso Basso Alto Alto
Expr. level Alto Basso-Alto Basso-Alto Basso-Medio
Expr. extracell Periplasma Terreno Terreno Terreno
Modifiche Postraduzionali
Folding Corretto Non sempre Non sempre Si Si
N-glicosilazione NO High lev Mannosio Semplice Complessa
O-glicosilazione NO SI SI SI
Fosforilazione NO SI SI SI
Acetilazione NO SI SI SI
Acilazione NO SI SI SI
γ-Carbossilazione NO NO NO NO
Piante geneticamente modificate
La rigenerazione nelle piante
Coltura dei protoplasti su cellule nutrici
Coltura di callo
Rigenerazione Coltura di cellule in sospensione
Centrifugazione e recupero dei protoplasti
Coltura di protoplasti Si sterilizza una foglia e si “pela” uno strato di
epidermide
Si pone lo strato di epidermide su un terreno contenente cellulasi e
pectinasi
Coltura di Calli
Induzione di radici su terreno ad alto rapporto
auxina/citochinina
Induzione di germogli su terreno a basso rapporto
auxina/citochinina
8
Agrobacterium Tumefaciens
La tecnologia ricombinante nelle piante
Agrobacterium tumefaciens. Agrobacterium tumefaciens è l’agente del tumore del colletto o della galla, malattia che si manifesta con la formazione di neoplasie sulla pianta infettata. L’instaurarsi della malattia richiede che nel genoma della pianta si inserisca il T-DNA, che corrisponde ad una parte del plasmide batterico (Ti-plasmid) detto induttore di tumore (Tumor inducing).
Il plasmide Ti contiene diverse informazioni
• Geni vir: codificano per proteine Vir, che permettono l’inserzione del T-DNA nella cellula ospite
• Geni per Opine (sintesi e catabolismo): codificano per enzimi in grado di trasformare aminoacidi e zuccheri della cellula in composti che solo il batterio è in grado di metabolizzare grazie a specifici enzimi sempre codificati dal plasmide Ti.
• Geni induttori del tumore: codificano per enzimi necessari alla sintesi degli ormoni vegetali che provocano la crescita incontrollata della cellula infettata
• T-DNA:
porzione di DNA delimitata da specifiche sequenze (bordo destro e sinistro) che corrisponde al DNA trasferito alla cellula ospite. Codifica per gli enzimi necessari alla sintesi degli ormoni vegetali e quella delle opine
11
o Contatto con bersaglio (geni chv)
o Adesione superficiale (vitronectina) o Trasferimento T-DNA (geni vir)
12
13
La conseguenza diretta dell’inserzione del plasmide Ti nella cellula è la crescita di un’escrescenza tumorale di tipo “Crown Gall” (tumore del colletto)
Un processo del tutto analogo si ha con un’altra specie di batterio. L’ Agrobacterium Rhizogenes, infatti, mediante meccanismi molecolari analoghi a quelli utilizzati da A. Tumefaciens, genera dei tumori identificabili come formazioni piliformi in soprannumero, soprattutto a livello radicale. Si parla infatti di formazioni di tipo “Hairy Roots”.
L’A. Rhizogenes, si serve per l’infezione, come A. Tumefaciens di un plasmide particolare (Ri) contenente geni deputati ai meccanismi di virulenza e di trasporto e integrazione, nel genoma della cellula ospite, della sequenza da trasferire.
Metaboliti indotti dal plasmide Ti
Auxine e citochinine: ormoni vegetali che regolano la crescita Opine: prodotti di condensazione tra aminoacidi, chetoacidi e zuccheri
Il metabolismo delle opine
Reazione di biosintesi della octopina
Octopina: piruvato + arginina Nopalina: α-chetoglutarato + arginina Mannopine: mannosio + aminoacido
Sintesi di Auxina e citochinine
I plasmidi Ti possono essere ingegnerizzati in E.coli attraverso l’inserzione del gene d’interesse all’interno della zona T. Questi plasmidi vengono usati per veicolare nuovi geni all’interno dell’ospite vegetale
Agrobacterium tumefaciens
DNA contenente il gene prescelto
Plasmide Ti
1
Inserimento del gene nel plasmide mediante l’enzima di restrizione e la DNA-ligasi
Plasmide Ti ricombinante
2
Infezione di cellule vegetali in coltura
3
Crescita della pianta
Pianta con caratteristiche nuove
Il T-DNA inserito porta il nuovo gene
Cellula vegetale
T-DNA
Sito di restrizione
I SISTEMI VETTORI DERIVATI DAL PLASMIDE Ti
Sistema vettore binario Sistema vettore cointegrato
Confine destro
Confine sinistro
A. tumefaciens ori
Gene bersaglio Gene marcatore selezionabile vegetale
E. coli ori
Gene marcatore per E. coli e A. tumefaciens
Vettore binario
Gene marcatore selezionabile
vegetale
Confine destro
Gene bersaglio
E. coli ori
Gene marcatore per E. coli e A. tumefaciens
Confine sinistro
A. tumefaciens ori
Geni vir
Vettore cointegrato
Plasmide Ti disarmato
Sequenza DNA omologa RICOMBINAZIONE
La piastra per l’inoculazione è provvista di cellule nutrici (protoplastiche) ed è selettiva per plasmidi resistenti ad un antibiotico (Canamicina).
excisione di dischi fogliari di circa 2 mm
Breve incubazione dei dischi fogliari con una coltura di Agrobatteri (5-10 x 106/ml) contenenti il gene d’interesse clonato in un vettore binario
Co-coltivazione in terreno a basso rapporto auxina/ citochinina, in presenza di carbellicina o kanamicina
Dopo la germinazione i trasformanti si trasferiscono in terreno di radicazione
La piastra per l’inoculazione è provvista di cellule nutrici (protoplastiche) ed è selettiva per plasmidi resistenti ad un antibiotico (Carbellicina o Kanamicina)
Questa tecnica è ormai di routine nella trasformazione di un gran numero di dicotiledoni.
L’utilizzo di questa tecnica nelle monocotiledoni è possibile solo se l’Agrobacterium è trattato con un essudato di ferite di piante normalmente suscettibili al batterio (dicotiledoni come i tuberi della patata).
La trasformazione tramite agrobatterio tuttavia ha un’efficienza molto bassa nelle monocotidedoni. Per queste piante, di grande interesse agronomico, sono stati sviluppati sistemi di trasformazione alternativi.
• Trattamento di protoplasti con metodiche analoghe a quelle utilizzate per le cellule in coltura
- fosfato di calcio (bassa efficienza) - elettroporazione (alta efficienza)
• Bombardamento con microparticelle
BOMBARDAMENTO CON MICROPROIETTILI
Tessuto vegetale bersaglio
Promotore per cellule vegetali gene d’interesse
Ap ori
Microparticelle (1µm) di tungsteno
Precipitazione del DNA sulle microparticelle
Caricamento del cannoncino balistico
Piastra di trattenimento
Percussore
Carica a salve
microproiettile
microparticelle rivestite di DNA
Metodi alternativi di trasferimento genico vegetale: cannoncino balistico
25
Le particelle di tungsteno (oro, plastica) su cui è adsorbito il DNA estraneo, non interferiscono con la crescita della pianta.
Il rivestimento delle particelle sferiche (0,4 - 1,2 m) con DNA si ottiene mediante precipitazione con CaCl2, spermidina o PEG (polietileneglicol).
Le particelle rivestite vengono accelerate ad alta velocità (da 300 a 600 m/s) con il cannone da particelle, che impiega la polvere da sparo, l’aria compressa o l’elio per fornire la forza propulsiva.
Le cellule situate nella traiettoria diretta del tiro vengono uccise, ma c’è una zona in cui il proiettile penetra le cellule senza ucciderle.
Il proiettile è in grado di penetrare almeno uno strato di tessuto (ad es: fogliare) e può quindi raggiungere il mesofilo.
27
Parametri importanti per il processo biolistico sembrano essere:
o Dimensioni dei microproiettili: in funzione della parete della cell target
o Massa dei microproiettili: deve poter raggiungere una energia cinetica adeguata all’attraversamento delle pareti cellulari.
Oro e tungsteno sembrano i più adatti anche perché chimicamente inerti e quindi non reagiscono con le componenti cellulari.
o Energia cinetica dei microproiettili: in funzione dello spessore della parete e dello strato di cellule che costituisce il bersaglio. Viene regolata calibrando l’accelerazione dei microproiettili.
o Numero di bombardamenti: variabili in base al bersaglio. Maggiore è il numero di bombardamenti maggiori sono i danni al tessuto.
Questo metodo di trasformazione, come tutti, presenta:
Vantaggi
Svantaggi
o Metodo genotipo indipendente
o Può essere applicato a tutti i tessuti modificando i parametri di sparo
o Frammentazione del DNA
o Profilo di integrazione del DNA complesso
o Integrazione di un gran numero di copie del transgene
Elettroporazione
L’ elettroporazione a partire da protoplasti risulta essere il metodo più efficace qualora non sia possibile utilizzare la trasformazione mediata da A. Tumefaciens.
Efficienza di trasformazione tra lo 0,1 e l’1% in protoplasti di riso e mais.
Un’ alta concentrazione di DNA plasmidico contenente il gene di interesse viene mescolata a una sospensione di protoplasti e sottoposti per pochi secondi ad un intenso campo elettrico dell’ordine di 250-500 V/cm.
In realtà l’intensità del campo elettrico varia in base al tipo cellulare, alla specie di provenienza, alla fase del ciclo cellulare in cui si trova e quindi a tutta una serie di parametri che rendono indispensabile una valutazione del voltaggio caso per caso.
Inoltre è necessaria anche una valutazione circa i sali impiegati. Molto spesso, infatti, erronee valutazioni dei parametri di reazione portano alla morte di un gran numero di cellule.
L’elettroporazione è per lo più impiegata in processi di trasformazione su “larga scala”, come la creazione di libraries genomiche. Per trasformazioni di un singolo plasmide vengono impiegate altre tecniche, come lo shock termico, a efficienza minore, ma più semplice e meno costoso.
Il trattamento provoca la formazione di pori transienti sulla membrana delle cellule e quindi la possibilità di entrata del DNA.
Trasformazione mediata da Liposomi
Il DNA viene incapsulato in un liposoma artificiale. La membrana dei liposomi si fonde con quella dei protoplasti ed il DNA può entrare nel nucleo.
Permeabilizzazione mediata da PEG
Microiniezione
Laser microbeam
Viene utilizzato per il trasferimento genico in situ. Il DNA viene introdotto negli organi riproduttivi.
Presenta come svantaggi la necessità di apparecchiature complesse e implica la trasformazione di una cellula alla volta.
Il polietileneglicole permette di permeabilizzare la membrana cellulare ed è quindi utilizzabile per la trasformazione diretta di protoplasti mediante semplice uptake di DNA estraneo.
Anche in questo caso si ha necessità di apparecchiature complesse e si può trasformare una cellula alla volta.
APPLICAZIONI
PIANTE TOLLERANTI A STRESS E SENESCENZA
La maturazione dei frutti
Alcuni dei geni indotti nel corso della maturazione dei frutti codificano gli enzimi cellulasi e poligalatturonasi.
Si è quindi supposto di poter ritardare la maturazione interferendo con l’espressione di uno o più di questi geni, creando piante transgeniche produttrici di RNA antisenso per i suddetti geni.
Pomodori Flavr Savr
Pomodori GM attraverso l’inserimento del gene codificante per Rna antisenso in grado di silenziare il gene della Poligalatturonidasi
enzima responsabile della maturazione del pomodoro wild type
Risultato: il processo di degradazione del frutto viene notevolmente rallentato.
ACC deaminasi
NH4+ + α- Chetobutirrato
Il regolatore della crescita della pianta è l’ETILENE che inducel’espressione di una serie di geni che partecipano alla maturazione e alla senescenza dei frutti.
Gene esogeno
PIANTE TOLLERANTI STRESS E SENESCENZA
Stress ossidativo
Piante di tabacco trasformate con un gene della superossido dismutasi (SOD) controllato dal promotore 35S del virus del mosaico del cavolfiore hanno espresso l’enzima acquistando la tolleranza al danno da radicali ossigenati.
PIANTE RESISTENTI A PARASSITI E VIRUS
LE PIANTE RESISTENTI AGLI INSETTI
Per conferire resistenza agli insetti predatori sono state poste in opera parecchie strategie, e una di esse si basa sul gene di una protossina insetticida prodotta da un a tra le parecchie sottospecie del batterio Bacillus thuringiensis:
Spcr
tNOS
p35S
gene della tossina B.t.
Confine destro
Plasmide Ti
Sequenza di DNA omologa
Ori di E.Coli
tNOS
pNOS
Gene marcatore sel. Vegetale (neomicina fosfo-transferasi NPT)
VETTORE DI CLONAZIONE COINTEGRATO
IL GENE DELLA PROTOSSINA E’ STATO INTRODOTTO IN MOLTE SPECIE DI PIANTE
PATATA RISO MAIS MELO MELANZANA RAVIZZONE NOCE PIOPPO ABETE MIRTILLO COTONE
Bacillus thuringiensis La tossina Bt
• Gli insetti ingeriscono i cristalli parasporali
• L’ambiente alcalino dell’intestino (pH7.5-8.0) solubilizza il cristallo a formare la protossina • Specifiche proteasi digestive presenti nell’intestino dell’insetto tagliano la protossina generando la tossina attiva • Nell’uomo e negli animali non sono presenti le proteasi specifiche • La tossina si inserisce nella membrana delle cellule epiteliali dell’intestino creando un canale ionico • Ciò determina un’alterazione dei flussi ionici e quindi la lisi delle cellule epiteliali • L’insetto smette di mangiare, si disidrata e muore
Modo di azione delle tossine di B.thuringiensis
Modo di azione delle tossine di B.thuringiensis
Applicazioni delle tossine di B.thuringiensis
Mais Bt
Bacillus Thuringiensis è un batterio che produce diversi tipi di endotossine tossiche per diversi parassiti delle piante ma non per l’uomo, gli animali o altri insetti benefici.
Vantaggi: - L'agricoltore non ha più bisogno di ricorrere agli insetticidi, quindi l'ambiente circostante non è più esposto a dosi massicce di insetticida nocivo. Svantaggi: - Gli insetti sono avvelenati per un periodo di tempo superiore rispetto a ciò che avviene quando un agricoltore irrora una o due volte i campi. In questo modo gli insetti possono sviluppare una resistenza al veleno. - Una moltitudine di insetti rischia di essere uccisa, compresi gli insetti predatori che si nutrono di insetti dannosi per le colture.(Negli Stati Uniti, dove si fa gran uso di Bt-mais, si è acceso il dibattito sugli effetti nocivi del Bt-mais sulla splendida farfalla monarca.) -Il cotone e le patate sono altri esempi di piante geneticamente modificate che producono insetticida.
ALTRE TECNICHE PER CONFERIRE
RESISTENZA AGLI INSETTI
Gli inibitori delle proteasi
L’inibitore dell’α-amilasi
Il gene batterico della colesterolo ossidasi
tNOS
p35S
Gene inibitore della tripsina di V. sinensis
Confine destro
Plasmide Ti Gene NPT
Ori
tNOS
pNOS
Kan r
Confine sinistro
PIANTE RESISTENTI AI FUNGHI E AI BATTERI
Le piante rispondono spesso all’invasione di un patogeno o ad altre sollecitazioni ambientali sintetizzando un gruppo di proteine dette proteine correlate con la patogenesi (PR). Le proteine PR comprendono le chitinasi, le β-1,3-glucanasi, le proteine traumatina-simili e gli inibitori delle proteasi. Per realizzare piante resistenti ai funghi patogeni sono state attuate manipolazioni tali da consentire alle piante di esprimere costitutivamente una o più proteine PR.
Cassetta del gene di resistenza all’igromicina
Cassetta del gene della chitinasi
La realizzazione di piante di patata transgeniche in grado di esprimere attivamente il lisozima del batteriofago T4 ha dato luogo a specie resistenti al batterio patogeno del suolo Erwinia carotovora e altri microrganismi
p35S
Pep. Segnale della α-amilasi di orzo
Lisozima T4 tCaMV
PIANTE RESISTENTI AI VIRUS
I virus delle piante causano spesso danni considerevoli alle coltivazioni e ne riducono significativamente le rese.
Per tale motivo si è fatto recentemente ricorso alle tecniche di ingegneria genetica per realizzare piante transgeniche resistenti ai virus.
E` stato osservato che piante transgeniche, che esprimono un gene che codifica una proteina di rivestimento di un virus, risultano resistenti all'infezione da parte di quel virus
Il meccanismo di resistenza si basa su una sorta di silenziamento, per cui la presenza di tale gene nel genoma delle cellule vegetali interferisce con la formazione di particelle virali quando queste infettano la cellula , interrompendo così il ciclo di replicazione del virus.
Le proteine di rivestimento espresse sono quelle del virus del mosaico del tabacco (TMV), virus del mosaico del cavolfiore (CaMV), virus del mosaico giallo della zucchina ecc.
RESISTENZA AI VIRUS
Geni delle proteine di rivestimento virali
Sequenze antisenso di geni virali
Per rendere le piante transgeniche resistenti a più di un virus, si è fatto uso di vettori binari basati sul plasmide Ti che esprimevano uno o più geni delle proteine di rivestimento:
Costrutti T-DNA con gene della neomicina fosfotrasferasi (NTP II) come marcatore selezionabile e gene della β glucuronidasi come gene reporter.
WMV2: Gene della proteina di rivestimento del virus 2 del mosaico dell’anguria.
CMV: Gene della proteina di rivestimento del virus del mosaico del cetriolo.
ZYMV: Gene della proteina di rivestimento del virus del mosaico giallo delle zucchine.
PIANTE RESISTENTI A ERBICIDI
STRATEGIE:
Inibire l’assunzione dell’erbicida
Sovraprodurre la proteina bersaglio sensibile all’erbicida così da farne rimanere abbastanza per le funzioni cellulari, nonostante la presenza dell’erbicida.
Attenuare l’attitudine della proteina bersaglio sensibile all’erbicida a fissare l’erbicida stesso.
Conferire alle piante la capacità di inattivare metabolicamente l’erbicida.
PIANTE RESISTENTI AL GLIFOSATO PIANTE RESISTENTI AL BROMOSSINILE
NITRILASI
• Il glifosato è un erbicida sistemico ad ampio spettro,non selettivo
• E’ letale per tutti i tipi di piante • L’erbicida è assorbito attraverso le foglie e i tessuti giovani del fusto e trasportato in tutta la pianta • Le piante trattate muoiono in giorni o settimane • Il Glifosato agisce inibendo l’azione dell’enzima vegetale EPSP(5-enolpiruvil shikimato-3-fosfato sintasi) implicato nella sintesi degli aminoacidi aromatici
L’ebicida glifosato
Aminoacidiaromatici
resistente all’erbicida glifosato
La Soia Runpdup è stata ottenuta attraverso l’inserimento del gene per l’ESPS batterico, un enzima con bassa affinità per il glifosato, che permette alle piante transgeniche di sopravvivere in presenza del glifosato.
Soia Rundup
Vantaggi: - Si può estendere la piantagione perché è più semplice combattere le erbacee insetti infestanti. - Si possono usare tali erbicidi per eliminare numerose specie di infestanti nella coltura senza distruggere le piante-GM,riducendo il numero di trattamenti spray con erbicidi che distruggono solo una o poche specie di infestanti. Svantaggi: -La soia può impollinare e trasmettere i geni alle erbacce che crescono nello stesso campo, rendendo così resistenti anche le erbe infestanti.
Vantaggi: - Si può estendere la piantagione perché è più semplice combattere le erbacee insetti infestanti. - Si possono usare tali erbicidi per eliminare numerose specie di infestanti nella coltura senza distruggere le piante-GM,riducendo il numero di trattamenti spray con erbicidi che distruggono solo una o poche specie di infestanti. Svantaggi: -La soia può impollinare e trasmettere i geni alle erbacce che crescono nello stesso campo, rendendo così resistenti anche le erbe infestanti.
MIGLIORAMENTO DELLE QUALITA’ NUTRIZIONALI
La SOIA TRANSGENICA è arrichita di acidi grassi insaturi per risolvere molte patologie cardiovascolari (trombosi,arteriosclerosi…) che affliggono una larga fetta della popolazione adulta dei paesi sviluppati.
Il GOLDEN RICE. Nel 1991, gruppi di ricerca di Zurigo (una squadra guidata dal Dr. Ingo Potrykus dell'Istituto Federale Svizzero di Tecnologia) di Friburgo e della Germania (Beier et al.) hanno sviluppato l'idea di introdurre il beta-carotene nell'endosperma del riso, per poter tentare di convertire questa coltivazione primaria in una fonte di Vitamina A nelle zone afflitte da VAD (vitamin A deficency). I ricercatori hanno manipolato geneticamente una varietà da laboratorio di riso giapponese (Taipei 309, adatto al clima temperato dellíEuropa piuttosto che a quello delle aree tropicali) introducendo una via metabolica per convertire in Beta-carotene una parte di un precursore ormonale (geranyl geranyl difosfato) presente nel riso. Nel gennaio 2000 il gruppo di scienziati ha pubblicato i suoi risultati su "Science“. Il principale finanziatore del progetto per il riso GM negli ultimi sei anni è stata la Fondazione Rockefeller.
Golden Rice La carenza di vitamina A causa la cecità parziale o totale a 500.000 bambini ogni anno, ma i metodi tradizionali di miglioramento sono stati
inefficaci nel produrre colture ad elevato livello in vitamina A.
Al contrario del riso wild type che produce beta-carotene solo nei compartimenti fogliari, il riso GM presenta un aumento nella produzione di beta- carotene a livello dell’endosperma (la parte commestibile del riso).
Il Golden Rice è stato ottenuto attraverso la trasformazione con 2 geni:
- psy (phytoene synthase) dal narciso (Narcissus pseudonarcissus)
- crt1 dal batterio della soia Erwinia uredovora
I geni psy e crt1 esogeni trasformati nel genoma nucleare del riso sotto il controllo di un promotore specifico per l’endosperma.
Via biosinteica del beta-carotene:
Gene lyc endogeno codificante per una ciclasi che permette trasformazione del licopene(rosso) in beta carotene (giallo).
desaturasi
I geni psy e crt1 esogeni trasformati nel genoma nucleare del riso sotto il controllo di un promotore specifico per l’endosperma.
Via biosinteica del beta-carotene:
Gene lyc endogeno codificante per una ciclasi che permette trasformazione del licopene(rosso) in beta carotene (giallo).
MODIFICA DEL CONTENUTO NUTRIZIONALE contenuto e tipo di lipidi
MODIFICA DEL SAPORE E DELL’ASPETTO DELLE PIANTE DA FRUTTO
Inibizione degli enzimi coinvolti nelle fasi iniziali dello scolorimento dei frutti e delle verdure (es. polifenolo ossidasi, che catalizzano l’ossidazione dei monofenoli e degli o-bifenoli ad o-chinoni).
PIANTE COME BIOREATTORI produzione di proteine ricombinanti polimeri per uso industriale (poli-idrossialcanoati)
OGM ANIMALI
Animali nei quali, grazie a procedimenti di ingegneria genetica, è stata
modificata,aggiunta o eliminata, una porzione di patrimonio genetico allo scopo di ottenere nuove caratteristiche, non presenti in natura e non ottenibili tramite incroci
VANTAGGI
Superamento barriere naturali di incompatibilità sessuale tra specie
Specificità di mutazione
Velocità di comparsa della mutazione
67
Per produrre animali geneticamente modificati si possono utilizzare:
Oociti fecondati inserendo il DNA estraneo nel pronucleo maschile.
Cellule staminali embrionali (in particolare ricavate dalla cavità della blastocisti).
Trasformazione Animale
• Negli ovociti prelevati da topine gravide si inietta il gene d’interesse, nel pronucleo maschile (è quello di dimensioni maggiori) • quando l’embrione arriva allo stato di blastula , viene impiantato in una topina pseudo-gravida (ottenuta tramite preparazione ormonale)
Microiniezione dell’uovo fecondato
La transgenesi avviene mediante microiniezione di un costrutto contenente il gene che codifica per la proteina di interesse in cellule uovo appena fecondate in vitro o in vivo (in questo caso le uova vengono recuperate mediante lavaggio uterino.
Generalmente vengono iniettati con una microsiringa 1-2 picolitri di DNA contenenti circa 100-200 copie del gene di interesse.
Il costrutto viene posto sotto un promotore specifico per il tessuto in cui si vuole ottenere l’espressione, ad esempio sotto il promotore per le caseine nel caso in cui si vuole espressione nella ghiandola mammaria e conseguente purificazione del prodotto di interesse nel latte.
Gli oociti così ingegnerizzati vengono poi trapiantati in femmine riceventi.
insieme al gene d’interesse si inserisce un gene per il colore del pelo, così riconosco subito tra la progenie il topo transgenico
Prelievo di un campione di tessuto per fare un’analisi Southern Blotting (per vedere in quante copie si è inserito il gene)
Si definisce fondatore (founder) l’individuo che porta il transgene anche nella linea germinale
Riconoscimento di una progenie transgenica
Sviluppo dello zigote fino allo stadio di blastocisti
Preparazione di cellule staminali embrionali (ES)
Si prendono delle cellule staminali embrionali dalla blastocisti e si mettono su piastra con un feeder layer
Le cellule staminali vengono manipolate geneticamente e poi reinserite in altre blastocisti accettrici prese da altre topine gravide.
Se le blastocisti attecchiscono e la gravidanza prosegue, nasceranno topi chimerici: avranno sia cellule normali che cellule transgeniche
Ogni cellula della blastocisti è il precursore di un tessuto del topo
Se l’inserzione è avvenuta nelle cellule della linea germinale, la progenie successiva porterà il transgene.
Questo metodo permette o un knock-out specifico di un gene, oppure una sostituzione di un gene con ricombinazione omologa.
La blastula si riorganizza bene dopo la colonizzazione delle blastocisti transgeniche e il topo non presenterà squilibri.
Trasferimento nucleare Clonaggio
Oocita privato del pronucleo femminile
Prelievo di un nucleo diploide da una cellula adulta
Inserimento del nucleo nell’oocita enucelato e stimolazione
L’oocita inizia lo sviluppo embrionale protando alla formazione di un individuo identico al donatore del nucleo
Non tutte le cellule somatiche sono in grado di originare individui clonati (le migliori sono: cellule epiteliali, cellule staminali, cellule germinali, cellule embrio-staminali o ES)
Trasferimento nucleare Clonaggio
Trasferimento nucleare - OGM
Cloning terapeutico
Terapia genica
TOPI KNOCK-OUT
Formazione di cellule staminali embrionali portatrici di una mutazione (knock-out)
Nel costrutto si utilizzano un gene di resistenza alla neomicina ed un gene di sensibilizzazione al ganciclovir.
Questo garantisce una doppia possibilità di selezione, positiva e negativa, che assicuri l’avvenuta ricombinazione omologa.
Questo sistema detto a “doppia selezione” consiste in:
o selezione positiva: sopravvivono solo le cellule che posseggono il gene di resistenza.
o selezione negativa: sopravvivono solo le cellule che non posseggono il gene di sensibilizzazione.
89
Procedura generale per produrre topi knock-out gene specifici
I topi chimerici ottenuti vengono analizzati per individuare quali tra essi posseggono il transgene nella linea germinale.
L’analisi viene condotta mediante screening della progenie.
Qualora il chimerico ha il transgene nella linea germinale la progenie sarà costituita interamente da topi transgenici.
Molecular Farming
La produzione di proteine ricombinanti è effettuata in molte specie animali, tra cui: mucche, capre, conigli, pecore e polli.
L’uso di promotori tessuto-specifici garantisce l’espressione della proteina transgenica nei fluidi corporei (latte,uova,sangue, urina e fluidi seminali) dai quali è possibile purificarla
Le ghiandole mammarie sono attualmente i bioreattori più efficienti sia per la grande quantità di latte prodotto, che l’elevata espressione della proteina transgenica (1g/L)
Più di 20 proteine sono state prodotte fino ad ora. Ad es.: anticorpi umani monoclonali, attivatore del plasminogeno tissutale, ecc.
Produzione di proteine ricombinanti nel latte Inserire il gene di interesse sotto il promotore del gene della beta-lattoglobulina
Prelevare cellule uovo fecondate dalla capra
Inserire il costrutto nel pronucleo di una cellula uovo
Impiantare in una madre psudogravida e selezione della progenie GM
Estrazione della proteina direttamente dal latte
Proteine terapeutiche prodotte in latte di animali transgenici
Proteine espresse Origine del transgene
Promotore Livello di esp (g/L)
Mucca
Lattoferrina
cDNA
Alpha-S1 caseina bovina
/
Capra
Anticorpi monoclonali
tPA
Genomico
cDNA
beta-caseina caprina
beta-caseina caprina
10
6
Maiale
Fattore VIII
Proteina C
cDNA
cDNA
Proteina acida di siero di latte murina (WAP)
3
1
Pecora
Alpha-1 antitripsina
Fattore IX
Fibrinogeno
Minigene
cDNA
genomico
beta-lattoglobulina ovina
beta-lattoglobulina ovina
beta-lattoglobulina ovina
35
0,005
5
Coniglio
Calcitonina
SOD
Eritropoietina
Ormone della crescita
IL-2
Proteina di fusione
cDNA
cDNA
Genomico
genomico
beta-lattoglobulina ovina
WAP murina
WAP di coniglio
WAP murina
beta-caseina di coniglio
2,1
2,9
0,05
0,05
0,0005
L’uovo fecondato nel magmun rappresenta un potenziale stadio d’intervento per il trasferimento genico. Sfortunatamente i pronuclei non possono essere subito visualizzati parché il tuorlo e l’opacità della membrana vitellina interferiscono con l’illuminazione
Produzione di proteine ricombinanti nell’uovo
La manipolazione viene effettuata sull’uovo appena deposto. Aprendo una fenditura sulla superficie del guscio si ha accesso alla blastocisti che può così essere manipolata (trasferimento di DNA o inserimento di cellule ES precedentemente manipolate). L’apertura sul guscio viene sigillata e l’uovo è incubato per permettere lo sviluppo dell’embrione, generando così individui chimerici.