il mitocondrio. fusione e fissione dei mitocondri i mitocondri sono organelli cellulari. essi sono...
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IL MITOCONDRIO
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FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI
I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico nel quale costantemente si fondono e si dividono
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PROTEINE DI FUSIONE
OPA 1: Proteina dello spazio intermembrana avente attività GTPasica
Mfn: proteina della membrana esterna con un dominio GTPasico e una regione Coiled coil
PROTEINE DI FISSIONE
Fis 1: Proteina della membrana esterna
Drp1: Proteina citosolica e mitocondriale avente attività GTPasica
PROTEINE COINVOLTE NELLA FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI
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TESSUTI DEI MAMMIFERI ALTERATI DA DIFETTI NELLE PROTEINE DI FUSIONE
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LA BIOGENESI DEL MITOCONDRIO
Il mitocondrio contiene unproprio genoma e apparatidistinti di replicazione,trascrizione e traduzione.Tuttavia l’mtDNA codificasolo per un ridotto numero di proteine (13) mentre ilresto è codificato dalDNA nucleare
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LE PROTEINE CODIFICATE DALL’mtDNA SONOCONTENUTE NEI COMPLESSI RESPIRATORI
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IL DNA MITOCONDRIALE DEI METAZOI
Costituisce circa l’ 1% del genoma: ogni cellula contiene da 103 a 104 copie di mtDNA
Codifica per 2 rRNA, 13 mRNA e 22 tRNA
Si trova in strutture ricche di proteine dette nucleoidi
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I nucleoidi rappresentano l’unità dinamica ed ereditaria dell’mtDNA
Vertebrati : 50 - 800 nucleoidi/cellula
2 a 6 nucleoidi / organello
2 a 15 molecole di mtDNA/nucleoide
I NUCLEOIDI
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PROTEINE ASSOCIATE CON I NUCLEOIDI NEI VERTEBRATI
Proteine coinvolte nel mantenimento, replicazione e/o trascrizione dell’mtDNA
CopurificazioneCon mtDNA
Distribuzioneintramitocondriale
LON proteasi N.D. N.D.BRCA1 N.D. NUCLEOIDIANT1 SI N.D.PDC-E2 SI. N.D.BCKD-E2 SI N.D.PHB2 SI N.D.
Proteine con funzione sconosciuta
Tra le proteine contenute nel nucleoide alcune hanno un ruolo noto nel metabolismo dell’mtDNA, altre non sono apparentemente collegateall’mtDNA dato che svolgono un ruolo a se stante.
CopurificazioneCon mtDNA
Distribuzioneintramitocondriale
POL G A Parziale MITOCONDRIPOLG B Parziale N.D.TwinkleMtSSB
Parziale NUCLEOIDI
TFAM SI NUCLEOIDIPOLRMT N.D. N.D.MtTFB (Xenopus) N.D. N.D.TFB1M (uomo) N.D. MITOCONDRITFB2M(uomo) N.D. MITOCONDRIRnase MRP N.D. N.D.
Parziale NUCLEOIDI
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Studi in cellule di lievito hanno portato alla proposta di un modello di rimodellamentodel nucleoide secondo il quale in seguito a cambiamenti del metabolismo cellulare (es situazioni di stress) l’aconitasiperderebbe il cluster Fe-Se si riposizionerebbe sul nucleoide, contribuendo a stabilizzare l’mtDNA
RIMODELLAMENTO METABOLICO DEI NUCLEOIDI MITOCONDRIALI
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MODELLO DI SEGREGAZIONE DEI NUCLEOIDI IN LIEVITO
Attraverso contatti con proteinedi membrana il nucleoide mitocondriale si collega al citoscheletro.In questo modo il nucleoide si muove con i mitocondri nelle cellule della progeniedurante la divisione cellulare
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IL DNA MITOCONDRIALE DEI METAZOI
•Costituisce circa l’ 1% del genoma: ogni cellula contiene da 103 a 104 copie di mtDNA
•Viene ereditato per via materna
•Viene riparato con scarsa efficienza
•Il processo di ricombinazione del DNA mitocondriale è poco efficiente
•Codifica per 2 rRNA, 13 mRNA e 22 tRNA
•Si trova in strutture ricche di proteine dette nucleoidi
•Nel mitocondrio esiste il fenomeno della eteroplasmia, ossiala presenza di più di un genoma mitocondriale nello stesso individuo
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La mancanza di ricombinazione del DNA mit potrebbe far pensare che il genoma mit si comporti come un organismo asessuato aploide, per cui l’accumulo di mutazioni deleteriepotrebbe determinare l’estinzione dell’organismo (Muller Ratchet).
Uno di questi meccanismi è detto bottleneck o campionamento
IL BOTTLENECK
Invece esistono meccanismi specifici che prevengono questa possibilità
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Il bottleneck rappresenta un esempio di replicazione rilassata del DNA mitper cui durante la citochinesi alcune molecole si replicano ed altre no.
Durante i primi stadi dell’ovogenesi avviene un campionamento delle molecole di DNA mit, fino a circa 200/cellula
Successivamente nell’ovocita primario il contenuto cellulare di mtDNA e di mitocondri aumenta considerevolmente fino a 100000 molecole di mtDNA/cellula.
MECCANISMO DEL BOTTLENECK
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Il campionamento (bottleneck) avviene durante lo sviluppo di un feto femmina destinato a diventare la madre nelle generazioni successive.
Il campionamento avviene in modo casuale senza meccanismi di selezione positivi o negativi
Mentre le cellule germinali primordiali non differiscono nel loro livello di eteroplasmia la drammatica segregazione dei genotipi mitocondriali che avvienedurante lo sviluppo degli ovociti primari dà luogo ad un alta varianza intercellulare
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Il campionamento dell’mtDNA porterebbe alla formazione di individui Omoplasmici nei quali si sarebbero perse le mutazionidebolmente deleterie prima che esse si accumulino.Ciò eviterebbe il verificarsi del “Muller ratchet”
Tuttavia le mutazioni che sfuggono a questa selezione che sono debolmente deleterie e che non vengono rimosse, sarebbero amplificate e potrebbero diventare omoplasmicheQuesto è probabilmente il meccanismo per la patogenesi
delle malattie mitocondriali ereditate per via materna
CONSEGUENZE DEL BOTTLENECK
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MODELLO ASINCRONO DI REPLICAZIONE DEL’mtDNA
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MODELLI COMPETITIVI DI REPLICAZIONE DELL’mtDNA NEI MAMMIFERI
Replicazione asincrona (Clayton)
ReplicazioneUnidirezionaleSincrona (Holt 2000)
Replicazione bidirezionaleda siti multiplidi inizio
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LA TERMINAZIONE PREMATURA DELLA REPLICAZIONEDELL’ mtDNA DIPENDE DAL SUO SITO DI INIZIO
L’origine localizzata in pos 57 è responsabile per il mantenimentodell’mtDNA in condizioni di steady state mentre le altre due origini sarebbero richieste per il recupero dopo la deplezione dell’mtDNA e peraccellerare la replicazione dell’mtDNA in risposta a richieste fisiologiche
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La replicazione dell’H-strand (modello Clayton) inizia nella regione non codificante e richiede la presenza di un primer ad RNA che è sintetizzato dallaRNA polimerasi mitocondriale apartire dal promotore PL. Il principale sito di inizio della replicazione si trova a livello di una sequenza conservata CSB-1che rappresenta il punto piùimportante per la transizionetra l’RNA primer e l’mtDNA
IL DNA MITOCONDRIALE UMANO
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TAS
RNA DNA
CSBs
5’ 3’
IL D-LOOP
Una notevole proporzione di molecole di mtDNA di mammifero contiene una struttura a tripla elica detta D-loop, costituita da un breve tratto distrand H nascente appaiata alla strand L templato, con conseguentespiazzamento della strand H materna. Le estremità 3’ del D-loop si trovano in corrispondenza di blocchi di sequenza conservate dette TASE’ stato proposto che la struttura del D-loop rappresenti una replicazioneabortiva e che il numero di copie dell’mtDNA possa anche essere regolatodall’espansione di questa struttura.
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FATTORI COINVOLTI NELLA REPLICAZIONEDELL’ mtDNA
La replicazione dell’mtDNA dipende da numerosi fattori, ognuno dei quali svolge un ruolo importante nel processo.
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SINTESI DEL PRIMER
Richiede:•mtRNA pol•Fattori di trascrizione TFAM
TFB1TFB2
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TFAM
•Attiva la trascrizione delle strand H ed L legandosi ai rispettivi promotori HSP E LSP
•Si lega al DNA anche in maniera regolare e senza specificità di sequenza svolgendo la funzione di histone-like protein
OH2 OH1
300
CS
B1
CS
B3
CS
B2
LSP HSP
TFAM
150 350 400 450 500 550200 250100
ITL ITH
•E’ essenziale per il mantenimento dell’ mtDNA in quanto la sua deplezione é letale
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TFAM, TFB1 E TFB2
TFAM LSP
TFB1
TFB2
• TFB1 e TFB2 sono due fattori proteici che insieme a TFAM stimolano la sintesi del primer
• Sembra che TFB1 e TFB2 colleghino TFAM con l’RNA polimerasi facilitando l’inizio della trascrizione
mtRNA pol.
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MATURAZIONE DEL PRIMER
RICHIEDE UNA RIBONUCLEOPROTEINA (MRP)
o
AVVIENE IN MODO PROTEINA INDIPENDENTE
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L’enzima MRP è un’endonucleasi costituita da una parte proteicae da una componente ad RNA.
Secondo gli autori l’enzima svolgerebbe il suo ruolo tagliandol’RNA e producendo il primer perla replicazione. Il taglio avverrebbe quando l’RNA è ibridizzato con il DNA stampo formando una struttura R-loop
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L’esistenza di strutture a singola strand nella regione CSB1 suggerisce che esse rappresentino dei siti di pausa della trascrizione. Pertanto la formazione del primer sarebbe indipendente dall’azione di una nucleasi
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Utilizzando un sistema purificato di trascrizione in vitro si è osservato che la trascrizione della strand L termina nel box CSB II.Pertanto anche questo studio sostiene che la formazione delprimer è indipendente dalla presenza della endonucleasi MRP
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LA TERMINAZIONE PREMATURA DELLA REPLICAZIONEDELL’ mtDNA DIPENDE DAL SUO SITO DI INIZIO
L’origine localizzata in pos 57 è responsabile per il mantenimentodell’mtDNA in condizioni di steady state mentre le altre due origini sarebbero richieste per il recupero dopo la deplezione dell’mtDNA e peraccellerare la replicazione dell’mtDNA in risposta a richieste fisiologiche
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FATTORI COINVOLTI NELLA REPLICAZIONEDELL’ mtDNA
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mtSSB
Proteina che lega il DNA a singolo filamento evitandone la rinaturazione
• stimola l’attività 3’-5’ esonucleasica e l’attività 5’-3’ polimerasica della DNA polimerasi . ed aumenta anche la processività dell’enzima
Il collegamento tra espressione di mtSSB e variazioni nel contenuto dell’mtDNA suggerisce che essa sia asssociata con meccanismi che regolano la replicazione o la stabilità dell’mtDNA
•Studi in Drosophila mostrano che l’espressione di mtSSB è regolata dal legame ad elementi DRE che controllano la replicazione del DNA di Drosophila. Ciò definisce un possibile legame tra replicazione nucleare e mitocondriale
• La deplezione di mtSSB induce la deplezione dell’mtDNA
ALTRE CARATTERISTICHE DI mtSSB
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ELICASI
E’ stata descritta una elicasi mitocondriale 5’-3’richiesta per la replicazionedell’ mtDNA
• L’attività di TWINKLE è stimolata da mtSSB
• Mutazioni nel gene per TWINKLE sono associate con delezioni multiple nell’mtDNA di pazienti sofferenti per l’adPEO• Studi con animali transgenici e esperimenti di RNAi hanno mostrato che l’espressione di TWINKLE è strettamente associata con il livello dell’mtDNA•TWINKLE, mtSSB e TFAM sono localizzate nei nucleodi
Essa è stata denominata TWINKLE (omologa alla elicasi-primasi di T7)
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Le sequenze TAS potrebbero essere un segnale di riconoscimento per una DNA-binding protein che potrebbefunzionare bloccando la progressione della forca replicativa Questa proteina potrebbe svolgere un azione antielicasica
COME VIENE REGOLATA L’ESTENSIONE DEL D-LOOP ?
RNA DNA
CSBs
5’ 3’
IPOTESI
TAS
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Gli autori identificano una proteina di circa 45KDa chesi lega alle regioni TAS A E TAS B del DNA mit umano
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P.lividusmtDNA
12 S Cyt b ND5ND6
FQ
T EQ
N C R
mtDBP
OH
mtDBP
P
mtDBP, THE D-LOOP BINDING PROTEIN IN SEA URCHIN
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• MtDBP works as a bidirectional transcription termination factor in an in vitro heterologous transcription assay.
bmtDBP - -
RO
TT
pDBP-term(F) pDBP-term(R)
mtDBP IS A TRANSCRIPTION TERMINATION FACTOR
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Is mtDBP involved in mtDNA replication, perhaps by
impeding the synthesis of nascent DNA (“contrahelicase
activity”) ?
NCR
1098 1126 1175
12S TE
OH
Q NPATG-rich
nascent H-strand
RNA primer
mtDBP AND mtDNA REPLICATION……..
mtDBP
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• Recombinant purified mtDBP
G-rich G-rich
mtDBPmtDBP
helicase substrates
• Partial duplex substrates that contain mtDBP binding site alone or followed by its flanking region, in both orientations
IN VITRO HETEROLOGOUS HELICASE ASSAY
•SV40 large T Antigen (replicative helicase)
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Substrate: mtDBP binding site
OH
DBP.For
T Ag
5’
3’
* 1090 1246
T Ag+ + + +
mtDBP
100 °C
100 86 65 37 10
*
* % helicase activity
+-
3’5’
T Ag
OH
10901246
*DBP.Rev
mtDBP
*
*
% helicase activity 100 95 90 44 5
+ + + + T Ag100 °C +-
DNA-BOUND MTDBP EXHIBITS A NON-POLAR CONTRAHELICASE ACTIVITY
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It terminates transcription bidirectionally
It is a bidirectional contrahelicase that could act as a negative regulator of mtDNA synthesis.
MTDBP IS A DUAL FUNCTION PROTEIN:
MtDBP could coordinate the interplay between replication and transcription.
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- block the replication fork in a polar mode (contrahelicase)- exert a polar stop to elongating RNA pol;
passage of an RNA transcript from the permissive side of DNA-protein complex causes dislodging of the protein: the arrested helicase is restored.
Bacterial factors Tus and RTP (D. Bastia and coll.):
blocking sidepermissive side
3’
5’
5’
3’
blocking side
RNApol
replic.
replic.
RNApol
replic.
replic.
PROKARYOTIC FACTORS MEDIATING TERMINATION OF TRANSCRIPTION AND
REPLICATION
Blocked RNApol
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What is the mechanism that allows
mtDNA synthesis to resume?
MODEL
Dissociation of DNA-bound mtDBP caused
by the passage, in the opposite direction,
of the RNA polymerase through the protein-
DNA complex.
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T7 RNA pol
T7 promoter
T7 RNA pol transcribes and invades mtDBP-DNA complex
mtDBP
T7 promoter
32PmtDBP is dislodged and trapped by a labelled DNA
probemtDBP
DNA template
DNA templatemtDBPT7 RNA pol
+ ++ + _+ _
+ +_ _ _+ _
+ ++ + + _ +
free oligonucleotide
mtDBP/DNA complex_
_
DNA:prot. 1:6 1:13
NTPs + _+ + + + +
IMPACT OF TRANSCRIPTION INVASION ON THE DNA-BOUND MTDBP
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Transcription invasion of the protein-DNA complex causes dislodging of mtDBP. The arrested helicase is restored and mtDNA replication can resume.
Readthrough transcription dislodges mtDBP
A POSSIBLE MODEL FOR THE ABROGATION OF mtDBP CONTRAHELICASE ACTIVITY
mtRNA pol
elongating H-strand
12S E T P Q
OH
DNA helicase
12S
arrested H-strandOH
TE P Q
mtRNA pol
G-rich
G-rich AT
AT
mtDBP
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DNA POLIMERASI
Nelle cellule animali la DNA polimerasi mitocondriale (DNA pol ) é una proteina costituita da due subunità:
• subunità catalitica con attività esonucleasica 3’-5’ ed attività polimerasica 5’-3’ di circa 140 kDa
•subunità regolatrice di 35-54 kDa
La subunità regolatrice è omologa alle aminoacil-tRNA sintetasi di classe IIEssa aumenta l’affinità della polimerasi per l’mtDNA epromuove un più forte legame dei nucleotidi aumentando la velocità di polimerizzazione
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REGOLAZIONE DEL NUMERO DI COPIE DEL DNA
Il numero di copie del DNA può dipendere:
da fattori direttamente coinvolti nella replicazione
da fattori coinvolti nella biogenesi del mitocondrio
da fattori coinvolti nel ciclo cellulare
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REGOLAZIONE DELLA BIOGENESI MITOCONDRIALE
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In risposta a danni al DNA, p53 interagisce con l’mtDNA e con la DNA polimerasi aumentando la velocità di replicazione
![Page 54: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico](https://reader035.vdocumenti.com/reader035/viewer/2022062319/5542eb5a497959361e8c6f6f/html5/thumbnails/54.jpg)
MODELLO PER LA REGOLAZIONE DEL NUMERO DI COPIEDELL’mtDNA DA PARTE DELLA VIA DI CONTROLLO
Mec1/Rad 53 DEL CICLO CELLULARE
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IL NUMERO DI COPIE DELL’ mtDNA DIPENDE DA FATTORI PROTEICI E DA ELEMENTI LIMITANTI COME IL POOL DEI NUCLEOTIDI
![Page 56: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico](https://reader035.vdocumenti.com/reader035/viewer/2022062319/5542eb5a497959361e8c6f6f/html5/thumbnails/56.jpg)
MAPPA DELLE MUTAZIONI PATOLOGICHE DEL DNA MITOCONDRIALE UMANO (DI MAURO 2005)
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ASPETTI CLINICI, MORFOLOGICI E BIOCHIMICI DI DISORDINI COLLEGATI A MUTAZIONI DELL’mtDNA
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GENI NUCLEARI COINVOLTI NEL MANTENIMENTODELL’mtDNA
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SOSTITUZIONI AMINOACIDICHE NELLA DNA POL RESPONSABILI DI MUTAZIONI PATOLOGICHE O DI POLIMORFISMI
AdPEO
Sporadic PEO
Sindromedi Alper
SANDO
Male infertility
Mutazioni autosomiche recessive