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Lentamente muore chi diventa schiavo dell'abitudine, ripetendo ognigiorno gli stessi percorsi, chi non cambia la marca, chi non
rischia e cambia colore dei vestiti, chi non parla a chi non conosce.Muore lentamente chi evita una passione, chi preferisce il nero subianco e i puntini sulle "i" piuttosto che un insieme di emozioni,
proprio quelle che fanno brillare gli occhi, quelle che fanno di unosbadiglio un sorriso, quelle che fanno battere il cuore davanti
all'errore e ai sentimenti.Lentamente muore chi non capovolge il tavolo, chi è infelice sul
lavoro, chi non rischia la certezza per l'incertezza, per inseguire unsogno, chi non si permette almeno una volta nella vita di fuggire ai
consigli sensati. Lentamente muore chi non viaggia, chi non legge, chinon ascolta musica, chi non trova grazia in se stesso. Muore lentamente
chi distrugge l'amor proprio, chi non si lascia aiutare; chi passa igiorni a lamentarsi della propria sfortuna o della pioggia incessante.
Lentamente muore chi abbandona un progetto prima di iniziarlo, chi nonfa domande sugli argomenti che non conosce, chi non risponde quando gli
chiedono qualcosa che conosce.Evitiamo la morte a piccole dosi, ricordando sempre che essere vivo
richiede uno sforzo di gran lunga maggiore del semplice fatto di respirare.Soltanto l'ardente pazienza porterà al raggiungimento di una splendida felicità.
P. Neruda
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"Sotto l'azzurro fitto del cielo qualche uccello di mare se ne va, nè sosta mai
perchè tutte le immagini portano scrittopiù in là".
Eugenio Montale
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IL MAPPAGGIO GENETICO
Caratteri mendeliani
Caratteri complessi
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IL MAPPAGGIO GENETICO
Caratteri mendeliani
Caratteri complessi
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OBIETTIVO
Determinare con quale frequenza due loci vengono separati dalla ricombinazione durante la meiosi
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Il mappaggio genetico
• Ricombinazione…
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linkage
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LOCI DISTANTI LOCI VICINI
AB
AB
AB
ab
ab
ab
A A
A
B
B B
a
b
a
b b
a
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DEFINIZIONE• Due loci si dicono in linkage quando la
loro frazione di ricombinazione è < 0.5
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FRAZIONE DI RICOMBINAZIONE
numero di ricombinantinumero totale meiosi
θ=
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Sono questi geni in linkage?
1. Dobbiamo analizzare un numero di famiglie chesono informative per i loci di interesse
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Sono questi geni in linkage?
2. Noi dobbiamo capire la fase
Aa aa
Bb bb
Aa aa
Bb bb
X
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Sono questi geni in linkage?3. Dobbiamo cercare di
capire se ognibambino ha unacombinazione di alleli parentale o se è un ricombinante
3 generazioni!!!
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Sono questi geni in linkage?
4. E’ più probabile che noi abbiamoosservato la particolare combinazione dialleli in quella famiglia perchè i geni sonoin linkage piuttosto che per il solo casodovuto ad assortimento indipendente deicromosomi!!
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Sono questi geni in linkage?
5. Usiamo il calcolo del lod score
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Sono questi geni in linkage?
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Sono questi geni in linkage?
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Come capire l’ordine dei geni e le distanze che li separano?A
B
C
D
Il metodo più diretto sarebbe calcolare la frazionedi ricombinazione tra geni malattia
Ma non avremmo i doppi eterozigoti!!!
Abbiamo bisogno di marcatori a posizione notae riferire la posizione dei geni rispetto a questi
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MARCATORI
Qualsiasi sequenza che consente di distinguere i cromosomigli uni dagli altri
Determinazione dei ricombinanti
Più i marcatori sono ravvicinati, maggiore la possibilità dideterminare la posizione dei geni con precisione
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I marcatori genetici
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STRs
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AATG AATG AATG AATG
AATG AATG AATG AATG AATG AATG
4 ripetizioni
6 ripetizioni
That’s the startpoint for modern abilityto perform human identity test
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CLONAGGIO POSIZIONALE
• Reclutare famiglie estese• Scansione dell’intero genoma• Testare più loci della stessa regione nelle stesse
famiglie e usare i ricombinanti per definirel’intervallo minimo dove cercare il gene
• Identificare i cloni di tutti l’area• Trovare tutti i geni dell’area• Trovare mutazioni presenti nei pazienti affetti• "Eureka!"
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Se dimostro che un carattere in una o più famiglie è in linkage con uno o piùmarcatori a posizione nota…
…la posizione del gene èprossima a quella del marcatore!
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CLONAGGIO POSIZIONALE
• Reclutare famiglie estese• Scansione dell’intero genoma• Testare più loci della stessa regione nelle stesse
famiglie e usare i ricombinanti per definirel’intervallo minimo dove cercare il gene
• Identificare i cloni di tutti l’area• Trovare tutti i geni dell’area• Trovare mutazioni presenti nei pazienti affetti• "Eureka!"
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STUDIO DI LINKAGE
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CLONAGGIO POSIZIONALE
• Reclutare famiglie estese• Scansione dell’intero genoma• Testare più loci della stessa regione nelle stesse
famiglie e usare i ricombinanti per definirel’intervallo minimo dove cercare il gene
• Identificare i cloni di tutti l’area• Trovare tutti i geni dell’area• Trovare mutazioni presenti nei pazienti affetti• "Eureka!"
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CLONAGGIO POSIZIONALE
• Reclutare famiglie estese• Scansione dell’intero genoma• Testare più loci della stessa regione nelle stesse
famiglie e usare i ricombinanti per definirel’intervallo minimo dove cercare il gene
• Identificare i cloni di tutti l’area• Trovare tutti i geni dell’area• Trovare mutazioni presenti nei pazienti affetti• "Eureka!"
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STUDIO DI LINKAGE
A B
C D E
D14S258 D14S26 D14S257 D14S123
1121
2334
3242
1121
1124
1122
1124
3241
2334
3242
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CLONAGGIO POSIZIONALE
• Reclutare famiglie estese• Scansione dell’intero genoma• Testare più loci della stessa regione nelle stesse
famiglie e usare i ricombinanti per definirel’intervallo minimo dove cercare il gene
• Identificare i cloni di tutti l’area• Trovare tutti i geni dell’area• Trovare mutazioni presenti nei pazienti affetti• "Eureka!"
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Quali cloni nella regione di linkage?
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CLONAGGIO POSIZIONALE
• Reclutare famiglie estese• Scansione dell’intero genoma• Testare più loci della stessa regione nelle stesse
famiglie e usare i ricombinanti per definirel’intervallo minimo dove cercare il gene
• Identificare i cloni di tutti l’area• Trovare tutti i geni dell’area• Trovare mutazioni presenti nei pazienti affetti• "Eureka!"
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Quali geni nella regione di linkage?
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CLONAGGIO POSIZIONALE
• Reclutare famiglie estese• Scansione dell’intero genoma• Testare più loci della stessa regione nelle stesse
famiglie e usare i ricombinanti per definirel’intervallo minimo dove cercare il gene
• Identificare i cloni di tutti l’area• Trovare tutti i geni dell’area• Trovare mutazioni presenti nei pazienti affetti• "Eureka!"
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Diagnosi indiretta per LINKAGE
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IL MAPPAGGIO GENETICO
Caratteri mendeliani
Caratteri complessi
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IL MAPPAGGIO GENETICO
Caratteri mendeliani
Caratteri complessi
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STUDIO DI LINKAGE NON PARAMETRICO
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AFFECTED SIB-PAIR (ASP)
Marker unlinked
TEST STATISTICO: ASP condividono più alleli al marker di quantoatteso
il marker è in linkage con il locus del GDS
25% 50% 25%
40% 55% 5%Marker linked
. . .
IBD=2
IBD=1
IBD=0
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1 2 3 4
1 3 1 4
allele 1 è IBD (e IBS)
1 2 1 3
1 3 1 2
allele 1 è IBS (no IBD)
1 1 3 4
1 3 1 4
allele 1 è IBS (IBD ?)
3 4
1 3 1 4
allele 1 è IBS (IBD ?)
IBD vs IBS
ATTENZIONE!!!Identici di fatto non è uguale a identici per discendenza
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11 13 14 15 16 17 18 19 20
ATOD5
PSORS8
PSORS2
ATOD4
PSORS5
ATODATOD
PSORS PSORS PSORSPSORS putativiputativi
ATOD putativiATOD putativi
ATOD3
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
PSORS9
PSORS3
ATOD5
PSORS1
PSORS5
ATOD1
PSORS7
PSORS4
ATOD2
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•• SiSi analizzanoanalizzano le le regioniregioni cheche hannohanno mostratomostrato linkage (linkage (nellanellascansionescansione del genoma)del genoma)
•• SiSi incrementaincrementa ilil numeronumero didi marcatorimarcatori delladella regioneregione in studioin studio•• RiduzioneRiduzione delladella regioneregione dada 10 a 5cM (=~ 5 10 a 5cM (=~ 5 MbasiMbasi))
Ulteriore evidenza di linkage
Mappatura fine della regione
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Association Studies• Compare allele frequencies in a set of
affected individuals to a set of controls• The genetic Case-control association design
is an important tool for mapping complex trait genes, but it may be influenced by population admixture / heterogeneity
• The control populations should be matched according to ethnicity as well as other potential confounding factors
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Definizione del genotipo: la ricerca del geneStudi di associazione:
Family-based
affetti vs non affetti
Caso-controllo
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TDT Design
A1 è trasmesso al malato ed è associato alla malattia
1 - 2 1 - 2
1 - 1
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Associazione Genetica=
Linkage Disequilibrium• Più il gene malattia è vicino al marcatore,più a
lungo l’associazione allele marcatore/malattiapersisterà
Locus 1 Locus 2
Disease locus
• Differenti popolazioni possono avere differenti“varianti” al locus marcatore
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Affetti Controlli
Gli studi di associazione ricercano differenze tra un gruppo di soggetti affetti e un gruppo di soggetti sani
Utilizzano il Linkage Disequilibrium per identificare segmenti ancestrali di cromosomi
rimasti inalterati poichè non soggetti a ricombinazione
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MUTAZIONE PRESENTE SUL CROMOSOMA FONDATORE
LA MUTAZIONE AVVIENE SU UN CROMOSOMA ANCESTRALE
ESPANSIONE DELLA POPOLAZIONE
FRAMMENTAZIONE DEL CROMOSOMA ORIGINALE IN SEGUITO A RICOMBINA-ZIONE
REGIONE CRITICA
Il Linkage Disequilibrium
Utilizza le ricombinazioniche avvengono in un’intera popolazione
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Il 65Il 65--85% del DNA 85% del DNA èè costituito da blocchi cromosomicicostituito da blocchi cromosomiciinscindibili che contengono fino a 12inscindibili che contengono fino a 12--20 SNPs20 SNPs
Questi blocchi sono separati gli uni Questi blocchi sono separati gli uni gli altri da hot spot di ricombinazionegli altri da hot spot di ricombinazione
Ridotta variabilitRidotta variabilitàà ((LDLD), maggiore facilit), maggiore facilitààdi mappare geni di suscettibilitdi mappare geni di suscettibilitàà
Il numero di SNPs da caratterizzare diminuisce, Il numero di SNPs da caratterizzare diminuisce, poichpoichéé non sono indipendenti tra loronon sono indipendenti tra loro
Hot Spot di
ricombinazione
Blocchidi LD
CromosomaCromosoma
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Ciascun blocco, in un individuo, può essere identificato da una specifica combinazione di alleli (SNPs).
G G A C A
AATATATCGCTATCCGTATACCTAATTGGGGGTGTGTGTACGTAATGCTAGCACGCGCGCCAGGATTAGCTGCCACA
AATATATCGCTTTCCGTATACCTAATTTGGGGTGTGTGTACGTAATGCTAGCACGCGCGCCAGGATTAGCTGCCACA
AATATATCGCTTTCCGTATACCTAATTTGGGGTGTGTGTACGTACTGCTAGCACGCGCGCCAGGATTAGCTGCCACA
AATATATCGCTATCCGTATACCTAATTTGGGGTGTGTGTACGTACTGCTAGCACGCGCGCTAGGATTAGCTGCCACA
AATATATCGCTATCCGTATACCTAATTGGGGGTGTGTGTACGTACTGCTAGCACGCGCGCTAGGATTAGCTGCCACA
AATATATCGCTATCCGTATACCTAATTGGGGGTGTGTGTACGTACTGCTAGCACGCGCGCTAGGATTAGCTGCCACA
ATTAAA
GTTTGG
AACCCC
CCCTTT
ATTAAA
GTTTGG
AACCCC
CCCTTT
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GENEGENE GENE
SNPsSNPsSNPs
Una volta identificata una regione di suscettibilità, si selezionano i geni e le regioni regolative conservate e si analizzano solo gli SNPs
in essi compresi
Il numero degli SNPs da tipizzare si riduce ulteriormente
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Associazione Genetica=
Linkage Disequilibrium• Più il gene malattia è vicino al marcatore,più a
lungo l’associazione allele marcatore/malattiapersisterà
Locus 1 Locus 2
Disease locus
• Differenti popolazioni possono avere differenti“varianti” al locus marcatore