gameti immaturi nelle tecniche pma: spermatidi
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GAMETI IMMATURI NELLE TECNICHE PMA:
SPERMATIDI
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Contenuto in DNA durante la spermatogenesi
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Classificazione degli spermatidi(Vanderzwalmen et al, 1997)
• spermatide maturo: spermatozoo con connessioni con le cellule del Sertoli
• spermatidi “elongated”: coda ben evidente, di lunghezza variabile
• spermatide “elongating”: coda visibile come protrusione laterale
• spermatide rotondo: cellula rotonda, con diametro di 7-8 micron, abbozzo dell’acrosoma visibile come uno spot chiaro o scuro, o come protrusione
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Indicazioni
Azoospermia secretiva dovuta a:
• ipospermatogenesi
• arresto maturativo “incompleto” allo stadio di spermatocita di I ordine
• arresto maturativo allo stadio di spermatide rotondo
• arresto maturativo “incompleto” allo stadio di spermatogone
• forme miste (Sertoli cell only syndrome “incompleta” e arresto maturativo)
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ICSI con precursori degli spermatozoi
• ELSI (Fishel et al, 1995): iniezione intracitoplasmatica di spermatidi allungati da cellule con un abbozzo di coda fino alle forme più mature con differenziazione completa ma unite alle cellule di Sertoli
• ROSI (Tesarik et al, 1995): iniezione intracitoplasmatica di spermatidi rotondi con o senza abbozzo del cappuccio acrosomiale
• ROSNI (Sofikitis et al, 1997): iniezione intracitoplasmatica del solo nucleo di spermatidi rotondi
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Iniezione di spermatidi rotondi (ROSI) e di nuclei di spermatidi rotondi (ROSNI): fase sperimentale
Autore specie tecnica risultato fattoremaschile
Ogura et al, hamster ROSNI+ES embrioni no
1993Ogura et al, topo ROSI+ES prole no1994
Sofikitis et al, coniglio ROSNI prole no1994
Kimura e topo ROSNI prole noYanagimachi, 1995
Sofikitis et al, coniglio ROSNI+ES prole no
1996
Goto et al, 1996 bovino ROSI blastocisti no
Sofikitis et al,1996 coniglio ROSNI+ES no gravidanze varicocele
Sasagawa e topo ROSI prole criptorchidismoYanagimachi,1997
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Iniezione di spermatidi: applicazione clinica (1)
Autore tecnica gravidanze aborti nati
cliniche
Hannay et al,1995 ROSNI 4 4 0
Tesarik et al, 1995 ROSI- eiaculato 2 0 2
Fishel et al, 1995 ELSI elongated 1 0 1
Mansour et al, 1996 ROSI 1 0 1
Tanaka et al, 1996 ROSI 1 1 0
Araki et al, 1997 ELSI elongated 3 0 4
Vanderzwalmen ELSI elongated/ 3 0 3et al, 1997 elongating
Vanderzwalmen ROSI 1 0 1et al, 1997
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Iniezione di spermatidi: applicazione clinica (2)
Autore tecnica gravidanze aborti naticliniche
Sofikitis et al, 1997 ROSNI 3 0 3
Amer et al, 1997 ELSI elongated/ 2 0 ?elongating
Sofikitis et 1998 ELSI elongated 2 0 2
Sofikitis et al, 1998 nucleo di 1 0 1spermatocita di II ordine
Kaharaman et al,1998 ELSI 2 1 2
Kaharaman et al,1998 ROSI 1 1 0
Barak et al, 1998 ROSI-eiaculato 1 0 1
Barros et al, 1998 ELSI 3 0 1
AL-Hasani et al,1999 ELSI 2 0 0
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Aspetti di laboratorio
ROSI ELSI
cicli 108 60
oociti iniettati 648 475
2 PN (%) 274 (31) 277 (58)
gravidanze cliniche 11 (11) 16 (18)
nati 10 13
% impianto 6.5 6.1
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Problematiche di laboratorio
• identificazione della cellula
• attivazione dell’oocita
• timing dei 2 pronuclei
• sviluppo embrionale
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Identificazione degli spermatidi rotondi
• TEM
• visualizzazione selettiva dell’acrosina o della proacrosina con anticorpi monoclonali
• FISH per la valutazione dell’aneuploidia
• Papanicolau
• Testsimplet
• microscopio cofocale
• microscopio con ottica Hoffman
• microscopio con contrasto di fase
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Spermatide rotondo:criteri per l’identificazione a fresco
• cellula rotonda con diametro di 6.5-8 micron (cellule più piccole)
• nucleo rotondo, centrale
• contorno liscio
• citoplasma uniformemente distribuito
• protusione laterale o spot a diversa densità ottica addossato al nucleo
• vitalità: resistenza all’aspirazione nella micropipetta
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Problematiche di laboratorio
fertilizzazione dell’oocita
• materiale genetico (DNA + nucleoproteine)
• asincronia maturativa
• fattore attivante l’oocita
• centrosoma
zigote e singamia
• comparsa dei 2 PN a 8-9 ore dall’iniezione
• singamia con presenza di 1 nucleo a 16-18 ore
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Metodiche per la preparazione
• separazione meccanica con aghi o vetrini
• digestione enzimatica:– collagenasi
– collagenasi + elastasi
– tripsina + DNAsi
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Rischi potenziali
legati alla tecnica
• aumentato rischio di mosaicismo per anomalie del centrosoma
• aumentato rischio di iniettare materiale diploide
• anomalie dell’imprinting
legati alla patologia sottostante
• mutazioni genetiche legate alla sterilità
• anomalie numeriche e traslocazioni
• AZF: AZFa (Sertoli cell-only), AZFb (arresto maturativo), AZFc (Sertoli cell-only “incompleta)
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Coltura in vitro di spermatidi(Fishel et al, 1998)
sopravvivenza
• 50% a 48 ore
• 0% a 96 ore
maturazione
• 8 % con crescita completa del flagello a + 4 ore
• 22 % con crescita completa del flagello da +8 ore