come separare questi oggetti 1 2 3 9 10 11 12 6 4 8 5 7 4 5 8 lana pietra cotone lana lana cotone...
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9 10 11 12
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4
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8
lana pietra cotone lana lana cotone pietra lana pietra cotone pietra cotone
cotone
lana
pietra
FormaGrandezzaDensità
forma
Densità
grandezza
Diversa grandezza Differente sedimentazioneDifferente velocitàdi rotolamento
4 6 7 85
1 3 4 6 7 8 9 10 11 122 5
Juang RH (2004) BCbasics
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Basic Principles of Protein Purification
Ammonium sulfate fractionation
Cell OrganelleHomogenization
MacromoleculeNucleic
acid Carbohydrate (Lipid)
Size Charge Polarity Affinity
Small molecule Cell DebrisProtein
Amino acid, Sugar,
Nucleotides, etc
Gel filtration,SDS-PAGE,Ultrafiltration
Ion exchange,Chromatofocusing,
Disc-PAGE,Isoelectric focusing
Reverse phasechromatography,
HIC,Salting-out
Affinitychromatography,Hydroxyapatite
Juang RH (2004) BCbasics
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Schema a Blocchi di un Sistema Cromatografico
RIVELATORE
colonna
pompa
Collettore di frazioniSoluzione di eluizione
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Scambio ionico: separazione in funzione della carica
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Importanza del pI
• -A pH > pI (almeno una unità) la proteina è carica negativamente e si lega a una resina a scambio anionico (SCAMBIO
ANIONICO).
• -A pH < pI (almeno una unità) la proteina è carica positivamente e si lega a una resina a scambio cationico (SCAMBIO CATIONICO).
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Eluizione:
-Variazione di pH-Variazione forza ionica-ioni competitivi
Scambiatrice di anioni:
-pH decrescente-forza ionica crescente-anioni competitivi
Scambiatrice di cationi:
-pH crescente-forza ionica crescente-cationi competitivi
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Cromatografia di scambio ionico• VANTAGGI
– Per grandi volumi,– Grandi quantità di proteina
(1-5 g proteina per 100 ml),
– Matrice molto robusta,– Condizioni molto flessibili,
possibili molte variazioni.
• SVANTAGGI– Proteine allo stesso pH e
concentrazioni di sali della colonna.
– Ciò può essere scomodo poiché poi occorre passare in dialisi per togliere i sali.
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GEL FILTRAZIONE
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Gel filtrazione
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Una proteina sconosciuta eluisce a 170 mL:
40,000 Da (40KDa)
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Cromatografia di affinità
OH
OH
OH
OOHO
OH
OH
OOH
Resina
Braccio spaziatore Ligando
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Cromatografia di affinità
• Un ligando ad alta affinità per la proteina è legato alla matrice
• La proteina di interesse si lega al ligando e viene immobilizzata sulla colonna
• Le altre proteine vengono “lavate” via.
• La proteina di interesse viene eluita usando una soluzione di ligando.
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Cromatografia di affinità
• VANTAGGI• Alta affinità, costanti
di dissociazione nell’ordine del mM, nM o anche pM.
• Legame tutto o nulla:• Possibili molte
variazioni (affinity tags)
• SVANTAGGI• L’ingombro sterico spesso
abbassa la capacità• Il braccio spaziatore può
avere influenza sul legame• L’eluizione può richiedere un
eluente specifico
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Affinity tags• Gli affinity tags sono si ottengono attraverso la preparazione di proteine
ricombinanti. Alla proteina di interesse è legato un tag che presenta affinità con un ligando:
• TAG– GST – MBP– biotina– Poli-His– Proteina A
• LIGANDO– Glutatione – Maltosio– Avidina– Nichel, Zinco– Anticorpi
• Le proteine contenenti affinity tags sono poi isolati per cromatografia di affinità con i ligandi legati alla colonna.
• Le proteine isolate possono poi venire primate degli affinity tag attraverso proteolisi specifica.
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Cromatografia di affinità con anticorpi
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Matrici attivate per immobilizzare uno specifico ligando
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Protocollo generale di purificazione proteine
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Obiettivi:
• Cattura– Isolare, concentrare e stabilizzare la proteina bersaglio
• Purificazione intermedia– Eliminare la maggior parte dei contaminanti
• Polishing– Ottenere la massima purezza possibile
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CONTROLLO DELLO STATO DI PURIFICAZIONE MEDIANTE ELETTROFORESI
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Gas cromatografia(Cromatografia di ripartizione gas-liquido)
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Schema a blocchi di un gascromatografo
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Esempio – separazione gas-cromatografica di urina di
paziente con elevata aciduria