cap.11 ottimizzazione della pcr
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Corso di genetica umanaTRANSCRIPT
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OTTIMIZZAZIONE della PCR
❖ Tecnica SEMPLICE,RAPIDA, SENSIBILE e DUTTILE
❖ Numerose APPLICAZIONI❖ Diagnostica: virologia, batteriologia, microbiologia❖ Genetica: sequenziamento, microsatelliti, linkage❖ Citogenetica: PRINS, IS PCR❖ Ambiente: Ricerca di patogeni in acque, cibi, matrici
alimentari❖ Medicina Legale: fingerprinting, diagnosi paternita’❖ Ricerca di Base: studi di espressione, studi
retrospettivi
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LE PAROLE MAGICHE DELLA PCR
❖ SPECIFICITA’❖ EFFICIENZA❖ FEDELTA’❖ Nf = N0 (1 + Y)n
equazione della PCR
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PCR IDEALE
❖ Alta specificita’, molta resa di prodotto di amplificazione, molto fedele.
❖ Max specificita’... minor resa...Sigh...❖ Alta fedelta’...poca resa...Acc...❖ Quando si costruisce un esperimento di PCR
occore sapere quale dei tre parametri e’ il piu’importante (es. sequenziamento diretto prodotti PCR e fedelta’)
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TIPI DI TEMPLATI DA AMPLIFICARE
❖ DNA genomico, plasmidico, di fago, cDNA, mRNA, DNA precedentemente amplificati (NESTED PCR) etc.
❖ ESTRAZIONE dell’acido nucleico e FONTE di PROVENIENZA
❖ Estrazione: occorre eliminare gli eventuali inibitori della Taq polimerasi.
❖ QUANTITA’ da utilizzare: 0.1-1 µg
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DIMENSIONI DEL TEMPLATO❖ Efficienza maggiore per templati di piccola taglia
piuttosto che per gli alti pesi molecolari❖ Rottura meccanica o mediante enzimi di restrizione
(con siti rari)❖ Controllo del templato (minigel), pulizia e
purificazione del templato❖ Quantizzazione del templato (gel +spettrofotometro)
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DISEGNO DEI PRIMERS
❖ SPECIFICITA’. Oligo V, Primer Express, Calcolo della Tm in base alla [primers] e [MgCl2]
❖ Applicazioni particolari ❖ PCR allele-specifica, clonaggio di geni
omologhi dove mancano informazioni sulla sequenza, ingegnerizzazione di nuove mutazioni o nuovi siti di restrizione: dei “mismacthes” vengono introdotti intenzionalmente o inevitabilmente
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SPECIFICITA’ DEI PRIMERS
❖ Lunghezza dei primers: da 15 a 30 basi, media 20 basi
❖ Probabilita’ di trovare una zona non desiderata in cui i primers non si ibridino: (1/4)(20+20)= 9 x 10-26
❖ Dimensioni Genoma aploide dei mammiferi 3x109 bp: e’ molto improbabile che un set di primers specifici per una regione, ne trovino un’altra perfettamente identica nel genoma
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MIX DI REAZIONE
❖ Buffer Standard: 50mM KCl, 10mM Tris-HCl (pH 8.3) 1.5mM MgCl2.
❖ [MgCl2] e stringenza della reazione❖ [dNTPs] fonte maggiore di gruppi fosfato, effetti
sulla [MgCl2] ❖ [KCl] influenza positiva sulla sopravvivenza
della Taq polimerasi (40’ a 95οC) ma influenza negativa sulla sua PROCESSIVITA’.
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PROCESSIVITA’
❖ NUMERO DI NUCLEOTIDI CHE LA POLIMERASI RIESCE AD INCORPORARE IN UNA SOLA VOLTA.
❖ AMPLITAQ POLIMERASI: 70 NUCLEOTIDI
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COSOLVENTI
❖ Triton X-100, Gelatina, BSA stabilizzazione dell’enzima
❖ Glicerolo, DMSO, Formamide, aumentano la specificita’ della reazione abbassando la Tm e di denaturazione del DNA: si facilita la denaturazione del templato e si aumenta la specificita’ di annealing dei primers.
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PRIMERS
❖ Rapporto tra [primers] e sequenza genomica target 108/1
❖ Eccesso di primers: il templato, una volta denaturato, si ibridera’ con i primerspiuttosto che con se stesso (reannealing)
❖ Se il rapporto primers/templato e’ troppo alto, rischio aspecifici, primer/dimer, concatameri, se il rapporto e’ troppo basso l’efficienza di PCR puo’ essere ridotta
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dNTPs
❖ [dNTPs] liberi dipende dal numero di sequenze target generate e dalla loro lunghezza.
❖ Eccesso di dNTPs effetti deleteri sull’efficienza di PCR
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CICLI TERMICI
❖ Accuratezza e Riproducibilita’ delle temperature
❖ Alte temperature di annealing e tempi brevi di annealing ed estensione
❖ PCR lunghe (>1Kb) aumento della durata dell’estensione (1’ ogni Kb)
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COINVOLTI NELL’AIDS PEDIATRICO
❖ STUDIO DELLE CHEMOCHINE E DEI RECETTORI DELLE CHEMOCHINE (CXCR5, SDF-1, CXCR4 ETC.)
❖ PCR ALLELE-SPECIFICA PER LO STUDIO DI DUE POLIMORFISMI PRESENTI NEL PRIMO ESONE DELLA PROTEINA SERICA LEGANTE IL MANNOSIO (MBP)
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OTTIMIZZAZIONE PCR-ALLELE SPECIFICA
❖ DISEGNO DEI PRIMERS ALLELE-SPECIFICI (PRIMER EXPRESS 1.0)
❖ HOT START FONDAMENTALE❖ REGOLA FONDAMENTALE: EVITARE
L’APPAIAMENTO TRA LE BASI G E T(PROBLEMI DI INGOMBRO STERICO)
❖ ADEGUATE CONDIZIONI DI STRINGENZA❖ SCELTA NUMERO CICLI AL FINI DI AVERE
UNA ELEVATA SPECIFICITA’ ANCHE A
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Thermostable DNA PolymerasesDomains
Proofreading activity
3’ EXO
5’ EXO Synthetic
DNARNAModified dNTP
CLeavageTaqman
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Enzyme Processivity
Number of consecutive nucleotides incorporated bya single average molecule of enzyme
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Enzyme Processivity
Number of consecutive nucleotides incorporated bya single average molecule of enzyme
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Enzyme Processivity
Number of consecutive nucleotides incorporated bya single average molecule of enzyme
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5’-3’ Exonuclease activity
90
Structure dependent endonuclease activity
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5’-3’ Exonuclease activity
70
Structure dependent endonuclease activity
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5’-3’ Exonuclease activity
72
Structure dependent endonuclease activity
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5’-3’ Exonuclease activity
72
Structure dependent endonuclease activity
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5’-3’ Exonuclease activity
72
Structure dependent endonuclease activity
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3’-5’ Exonuclease activity
A
C
Enzyme capability to correct for misincorporations
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3’-5’ Exonuclease activity
A
C
Enzyme capability to correct for misincorporations
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3’-5’ Exonuclease activity
A
G
C
Enzyme capability to correct for misincorporations
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Enzyme dependent PCR Features❖ Synthetic activityProcessivity :Stutter bands, Maximum Amplicon
lenght Mismatch Extension (SSP)RT-PCR
❖ 3’Exonuclease ActivityFidelityOverall cycle efficiency (eXtra Long PCR)
❖ 5’-3’ exonuclease activitylate cycles product cleavage, smear
Probe cleavage, Taqman Assay
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AmpliTaq GOLDFeatures
5’ EXO Synthetic
CLeavageTaqman
DNARNAModified dNTP
❖ Modified version of AmpliTaq DNA Polymerase❖ Same Processivity and Thermostability❖ Polymerization and 5’ Exo activities are thermally
activated❖ Activity release is progressive
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Non-Enzyme dependent PCR features
❖ Non specific amplicon generation❖ Specificity❖ Sensitivity❖ yield
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Sources of Non-Specificity
PrePre PCRPCR
Primer Dimerpre-PCR mispriming
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Primer Dimer Formation
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Pre-PCR Mispriming
DS Domain
denatured Domain
Sample DNA
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Pre-PCR Mispriming
DS Domain
denatured Domain
Sample DNA
![Page 35: Cap.11 Ottimizzazione Della PCR](https://reader034.vdocumenti.com/reader034/viewer/2022052504/552b0a7f4a79593a588b4567/html5/thumbnails/35.jpg)
Hot Start PCR
Reagents
Transfer to cycler
Cycle
Tube
4-25ÞC
Conventional PCR
Reagent subset
Heat to 60-70ÞC
Missing Reagent
75-80ÞC
Tube
Manual Hot Start PCR
Transfer to cycler
Cycle
4-25ÞC
AmpliWax
Heat 5-10 min.
to 35ÞC
Tube
Hot Start PCR with AmpliWax ®
PCR Gems
Reagent subset
Missing Reagent
Cycle
Transfer to cycler
75-80ÞC
4-25ÞC
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Sources of non specificity
❖ IN PCR
•Poor primer design•Wrong annealing temperature•Non optimal MgCl2 conc•Early cycles generation of non specific products
![Page 37: Cap.11 Ottimizzazione Della PCR](https://reader034.vdocumenti.com/reader034/viewer/2022052504/552b0a7f4a79593a588b4567/html5/thumbnails/37.jpg)
Early Cycles generation of Non Specific Products
60% Homology 50% Homology 40% Homology 100% homology
Annealed Primer
Free PrimerEven at stringency conditionsPrimers have a probability to annealto non fully complementary regions of DNA
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Early Cycles generation of Non Specific Products
Taq concentrationHIGH LOW
AvailabilityAvailability ofof free enzyme molecules isfree enzyme molecules is thethe limiting factor forlimiting factor for thethe extensionextension ofofmismis--annealed primersannealed primers.. Too much free enzymeToo much free enzyme in thein the reaction increasesreaction increases the chance the chance ofof generatinggenerating nonnon specific productsspecific products..
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Penalties of Non-SpecificityObscure specific product in agarose gel analysis
High background in quantitative PCR and sequencing of PCR product
Low product yield/sensitivity from depletion of PCRreactants
Apparent lack of intended product
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Factors Contributing toPrimer-Dimer formation
❖ Poor Primer Design❖ High Concentration of Primers❖ High Concentration of free Taq❖ low Kinetic Motions (low Temp)