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Affidabilita` di un’analisi.
- Specificita`:- esistenza di sostanze interferenti (dovrebbero essere assenti o in conc. nota)- controllo additivita` degli effetti interferenti
- Accuratezza: bonta` di approsimazione del valore sperimentale (media campionaria) al valore vero (media della popolazione). L’accuratezza di una procedura analitica viene stabilita attraverso:
- metodo assoluto: analisi campioni noti; analisi di standard.- metodo comparativo: confronto con altre tecniche; metodo del recupero
- Precisione: ripetibilita` del metodo analitico. La precisione deve essere fornita insieme al risultato dell’analisi ed e` valutata per mezzo di parametri statistici: deviazione standard
CV%=s/quantita` *100La precisione ottenuta dipende da quella di tutti gli strumenti impiegati per l’analisi
- Sensibilita`: rapporto tra risposta strumentale e quantita` dell’analita.concetti collegati sono:
- rapporto segnale/rumore (S/N)- minima quantita` rivelabile (LOD)- minima differenza rivelabile
)1(
)( 2
n
xxs
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Standardizzazione e Calibrazione
- Metodi Assoluti.
Sono metodi basati su una reazione chimica nota che va a completezza.
Peso: gravimetria; elettrogravimetria; trmogravimetria
Volume: titrimetria; gasometria
Carica tot: coulombometria
- Metodi Comparativi
Sono quei metodi analitici che richiedono una calibrazione con standard noti
al fine di ottenere risultati accurati.
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La calibrazione consiste nel determinare la relazione tra laGrandezza misurata (y) e la concentrazione dell’analita (C)
y = f(C) y = mC [+b]y = m log(C)
La calibrazione richiede la disponibilita` di standard primari.Nei metodi classici di analisi si usano standard primari e secondari.
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Funzioni di calibrazione lineariy = mC + b
y=parametro misuratoC=concentrazionem=costante di proporzionalita`b=termine costante (es. valore del bianco, errore determinato)
ERRORE DETERMINATO - errore misurabile e definito di cui si puo` tenere conto durante l’analisi.
ERRORE INDETERMINATO - errore che deriva dall’incertezza delle misure. E` incongnito e non puo` essere controllato dall’analista. Produce una dispersione dei risultati di misure ripetute che puo` essere valutata solo tramite test statistici.
Poiche` i punti di una calibrazione non cadono mai precisamente su una retta, si cerca la retta migliore col metodo della regressione lineare basata sul metodo dei minimi quadrati.
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Presupposti del Metodo dei minimi quadrati:- le variabili indipendente (C) e dipendente (y) sono legate da una
relazione lineare;- non vi sono errori associati ai valori noti di C degli standard.
Tutto l’errore sta nella misura di y;- non vi sono dati che cadono fuori dal pattern statistico di
distribuzione normale.
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Coefficiente di correlazione
(Pearson):
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Grafici di calibrazione non lineari
quando vi sono deviazioni dalla linearita` si puo` operare in modo da:
1) trasformare una o entrambele variabili (indip. e dipend.) e rendere la relazione tra le due di nuovo lineare
CkaykC
aCkykyay
aC
loglog10
loglog10
2) ricorrere alla regressione nonlineare
svantaggi legati al punto 2):
maggiore complessita` del metodo;errori maggiori legati alla procedura;necessaria buona conoscenza del metodo e dell’algoritmo applicato
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Metodi di aggiunta standardNon potendo eliminare o tenere esattamente conto di tutte le interferenze dovute alla matrice,la calibrazione viene svolta in presenza della matrice stessa.
Presupposti:- relazione lineare tra parametro misurato (y) e concentrazione (C) dell’analita (y=mC)- il metodo analitico non deve avere metodo determinato. Se la relazione e` del tipo y=mC+b, m deve essere nota.-la matrice non deve contenere specie che rispondolo come l’analita (ma con m in genere differente).
AGGIUNTA DI STANDARD SINGOLA
se = misura prima dell’aggiunta = conc. incognita dell’analita
= conc. dello standard nella soluzione dopo aggiunta = misura dopo aggiuntasi ha
si ricava
se le variazioni di volume non sono significative
)(0
si CCmy
mCy
sCC
iy
0y
0
0
yy
CyC
i
s
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volendo tener conto anche del volume dello standard aggiunto:
SVANTAGGI:- nessun controllo su eventuali errori commessi durante la misura o l’aggiunta- nessuna media che “abbatta” gli errori indeterminati- nessun modo di rivelare agenti interferenti o mascheranti
so
i CvV
VCmy
mCy
0
0
000
00
)(
)(
VyvVy
vVCyC
i
s
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METODO DELL’AGGIUNTA MULTIPLA DI STANDARD
si eseguono n aggiunte di standard contenente l’analita.dopo ogni aggiunta si ha (transcurando le variazioni di volume):
si riarrangia in
per
si ricava
volendo tener conto della diluizione, si ha:
da cui riarrangiando
0
,0
yy
CyC
i
is
0,0 y
C
Cyy isi
isC ,
iy
C
0yCy00iy
CC is ,
000
0,0
)(
)(
VyvVy
vVCyC
i
is
0,0
00
0
0 yCV
vV
C
y
V
vVy isi
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METODO DELL’AGGIUNTA MULTIPLA DI STANDARD
VANTAGGI:- l’errore indeterminato viene mediato dall’interpolazione grafica (regressione)- e` spesso possibile rivelare errori dovuti all’operatore (es. discontinuita` della retta)- e` spesso possibile identificare la presenza di interferenti e/o effetto matrice
- permette una determinazione quantitativa senza conoscere la matura della matrice
SVANTAGGI:- e` un metodo di estrapolazione e quindi meno preciso di quelli per interpolazione (regressione)- ogni determinazione richiede la ripreparazione degli standard e la costruzione della curva di calibrazione
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Le aggiunte sono in genere tutte uguali e il loro numero dipende da:- estensione del campo di linearita`- precisione richiesta
La quantita` aggiunta e` solitamente dello stesso ordine di grandezza di quella del campione.
CONFRONTO TRA PROCEDURE DI CALIBRAZIONE.
curva di calibrazione(validita` limitata all’immediata determinazione)(influenza dell’effetto matrice)
Metodo dello Standard InternoMetodo delle Aggiunte Standard
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Metodi dello Standard Interno
I metodi di costruzione della curva di calibrazione e di aggiunta standard presuppongono:
1)precisa conoscenza dei volumi di campione e di standard2)costanza e ripetibilita`dei fattori che influenzano la misura
Poiche` per alcune tecniche analitiche questo non e` sempre vero (vedi stabilita` nel tempo del detector), nasce la necessita` di confrontare la misura conquella fornita da uno standard interno aggiunto sia agli standard della calibrazione, siaal campione da analizzare.
Conseguenze: la variabilita` dei fattori che influenzano la misura si esplicitano sia sull’analitasia sullo standard interno e il rapporto delle loro risposte si mantiene costante (a parita` di concentrazione): maggior affidabilita` analitica e durata della curva di calibrazione.
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consideriamo
come l’equazione che esprime la risposta strumentale ad una certa concentrazione di due composti chimici diversi 1 e 2. Si avra` quindi:
analita
st. interno
se e derivano dalla stessa analisi, si ha e
FATTORE DI RISPOSTA
da cui:
METODO DELLO STANDARD INTERNO SINGOLO:1)si determina il valore di R da un’analisi fatta su un campione (+standard) noto2)si aggiunge una quantita` nota di standard al campione e si determina:
2222
1111
Cmky
Cmky
kmCy
2
1
22
11
2
1
C
C
km
km
y
y
1y 2y 21 kk
cost2
1 m
mR
2
1
2
1
C
CR
y
y
R
C
y
yC 2
2
11
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METODO DELLO STANDARD INTERNO MULTIPLO:si ripete la misura su soluzioni contenenti conc. variabili di analita e conc. costante di standard interno
Il METODO DELLO STANDARD INTERNO puo` essere applicato attraverso:- l’uso dei fattori di risposta:
partendo da un campione incognito, si prepara un campione in cui l’analita e` presente in quantita` incognita x e lo standard interno e` presente in quantita` nota z
1C2C
IS
A
IS
A
IS
A
C
C
m
m
y
y
IS
A
IS
A
C
CR
y
y
A
IS
IS
A
C
C
y
yR
z
x
z
x
C
CR
y
y
R
C
y
yC z
z
xx
-l’uso della retta di calibrazione:si preparano vari campioni contenenti quantita` note di analita e la stessa quantita` di
standard interno
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CONFRONTO FRA METODO DELLO ST. INTERNO SINGOLO E MULTIPLO:
- tempi di analisi: il metodo dello st. singolo e` molto piu` rapido: una volta determinato R bastauna sola misura, anche per piu` analiti (di cui sia noto il rispettivo R) in simultanea
- affidabilita` dei risultati: il metodo dello st. singolo e` meno affidabile perche` basato su una singola misura che puo` contenere errori casuali gravi, non mediati
- importanza della linearita`: nel caso dello st. singolo R e` assunto rigorosamente costante, mentrecon lo st. multiplo si costruisce una curva di calibrazione che potrebbe anche non essere lineare.
Le condizioni necessarie per poter applicare questi metodi sono:
- disporre di uno st. interno molto simile all’analita (chimicamente oppure in funzione della tecnica di analisi)
- lavorare all’interno del range operativo lineare
- se si utilizza un metodo di trattamento del campione e` necessario conoscere i recuperi relativiper l’analita e lo st. interno e correggere quindi le concentrazioni per tali fattori.
SCELTA DELLO STANDARD INTERNO:
un buon St. Interno deve essere:
- omologo all’analita (proprieta` chimiche e fisiche simili)- separabile dall’analita e dagli altri componenti del campione- non presente nel campione originale- non deve dare reazioni chimiche o altre interferenze col campione- miscibile col solvente impiegato per l’analisi
maggiore accuratezza e precisione(~0.5%) rispetto ad altreprocedure di calibrazione (~1-2%)
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METODO DELLA NORMALIZZAZIONE INTERNA:
Non e` previsto confronto con alcun standard.La somma delle aree dei picchi (es. analisi cromatogr.) e` posta = 100 e le aree dei singoli picchisono riportate come %
CASO 1: la risposta del rivelatore e` la stessa per tutti i campioni. In questo caso la conc. % dei componenti = AREA%
CASO 2: i componenti danno risposte diverse.Si devono determinare i fattori di correzione o fattori di risposta da un cromatogramma di composizione nota. I fattori di correzione possono anche essere non assoluti ma relativia quello di un componente, posto = 1.
Requisiti. tutti i componenti devono essere:- presenti e visibili nel cromatogramma- disponibili e reperibili per poter determinare il fattore di risposta
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Affidabilita` di un’analisi.
- Specificita`:- esistenza di sostanze interferenti (dovrebbero essere assenti o in conc. nota)- controllo additivita` degli effetti interferenti
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- metodo assoluto: analisi campioni noti; analisi di standard.- metodo comparativo: confronto con altre tecniche; metodo del recupero
- Precisione: ripetibilita` del metodo analitico. La precisione deve essere fornita insieme al risultato dell’analisi ed e` valutata per mezzo di parametri statistici: deviazione standard
CV%=s/quantita` *100La precisione ottenuta dipende da quella di tutti gli strumenti impiegati per l’analisi
- Sensibilita`: rapporto tra risposta strumentale e quantita` dell’analita.concetti collegati sono:
- rapporto segnale/rumore (S/N)- minima quantita` rivelabile (LOD)- minima differenza rivelabile
)1(
)( 2
n
xxs
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METODO DEL RECUPERO:
Il recupero si valuta misurando concentrazioni di analita aggiunte a campioni reali (campioni spiked).
Recupero(%) = [( C1 - C2 ) / C3 ]·100
dove:•C1: concentrazione dell'analita misurata dopo l'aggiunta •C2: concentrazione dell'analita misurata prima dell'aggiunta •C3: concentrazione aggiunta
Tanto più il recupero è prossimo al 100% tanto il risultato è buono sebbene un recupero del 100% non indichi necessariamente l'assenza di errori. Il risultato finale dell'analisi può essere espresso tenendo conto della correzione apportata in funzione del recupero. È possibile ottenere anche valori superiori al 100%.Solitamente un metodo analitico prescrive che si debba rientrare entro un ben definito intervallo di valori di recupero.
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CONFRONTO FRA TECNICHE ANALITICHE.(validazione di metodi)
relazione lineare tra le misure effettuate con due tecniche indipendentiavente pendenza = 1
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RAPPORTO SEGNALE/RUMORE (S/N)
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RAPPORTO SEGNALE/RUMORE (S/N) e LIMITE DI RIVELABILITA` (LOD)
LOD e` definito come:
se non e` presente un bianco daanalizzare si puo` utilizzarela dev. st. della regressione
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questo e` il metodo piu` preciso per determinare LODperche` utilizza insieme retta di regressione e concetti di statistica
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